鸡滑液囊支原体病的诊断及防控技术研究进展

刘廷江，张文婷，廖卫东，郭云清，胡 巧，翟新国，罗青平，3

（1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056000；2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室/畜禽病原微生物学湖北省重点实验室，武汉 430064；3.湖北洪山实验室，武汉 430070）

滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）是介于病毒与细菌之间的单细胞原核微生物，其外形多样，质地柔软，直径为0.2～0.4 μm［1］，能通过细胞滤器，革兰氏染色阴性［2］，低倍镜下观察菌落呈“煎蛋样”。MS 耐低温不耐高温，最适环境是37 ℃，pH 在7.5 左右［3］。

鸡（Gallus gallusf.domestic）感染MS 后会损伤呼吸道、关节腔和生殖系统［4］。MS 侵入呼吸道后可引起咳嗽、流泪、气管啰音，严重时有气囊炎［5］。关节肿胀型病鸡表现为关节和脚垫肿胀、跛行、胸部囊肿，肿胀处有乳酪色或灰白色脓性渗出物，后期形成干酪样物［6］。鸡生殖系统受到损伤后，会导致卵泡、输卵管发育不良，产蛋性能低下，产出软壳蛋，蛋壳尖端缺陷［7］。

滑液囊支原体的易感动物为鸡、火鸡和珍珠鸡，此外鸽、鸭、鹅、鹌鹑和麻雀也可感染［7］，第1 个感染高峰在7～12 周，第2 个感染高峰在产蛋期，感染后几乎终生带菌，但不一定发病［8］。该病既可通过呼吸道、消化道直接接触水平传播又可通过精液、输卵管垂直传播［9］。一年四季都可以发生，冬春季节发病概率较高［10］。此外，MS 还可以与禽流感病毒、新城疫病毒、大肠杆菌、巴氏杆菌和传染性支气管炎等病原体混合感染，加重病情，增加死亡率［11］。

在世界范围内，非洲和南美洲的MS 感染率较高，欧洲、亚洲、北美洲和大洋洲的感染率也在逐年上升，根据流行病学调查，支原体的感染率平均为70%～80%［12］。在中国，随着家禽养殖业不断发展，MS 的流行也呈上升趋势，2014 年后扩散至全国。MS 只有一个血清型，但基于vlhA基因5′末端的保守区域可将MS 分为17 个基因型（A-K）［10］。2016—2019 年，谢迪［13］对中国8 个省份进行了MS 的分子流行病学调查，发现在中国的MS流行基因型是K型。随朝鸽［14］于2017—2019 年在华中地区的MS 分型鉴定中确定了新的L 基因型。王晨燕等［15］于2018—2020 年在福建省对非免疫鸡群针对MS 进行了检测，鸡群病原总阳性率为49.62%，且阳性率随着鸡群日龄增加而升高。传播途径多样化和传播范围广泛给滑液囊支原体病的防治带来了较大挑战，研究简便、高效、精准的诊断技术及有效的预防、治疗方法对控制该病在中国的流行具有重要意义。

1 诊断方法

1.1 临床诊断

在实验室诊断之前，可通过对病鸡病理剖检进行初步诊断。若病鸡关节处有黄色脓性渗出物，胸部肿胀有黄色奶酪样物质或褐色分泌物可怀疑为滑液囊支原体感染［16］。在诊断时需将滑液囊支原体病与其他有相似症状的疾病区分开［17］，如沙门氏菌病、病毒性关节炎、维生素B 族缺乏症等。MS 病鸡表现为食欲下降，生长停滞，关节肿胀，跛行喜卧，排绿色稀便，剖检有腱鞘炎［18］。沙门氏菌引起的鸡白痢和鸡伤寒会导致病鸡不能站立，排白色稀便，剖检体内脏器有白色坏死灶。病毒性关节炎会导致病鸡跛行甚至瘫痪，无死亡，食欲和精神状态尚可［19］。维生素B 族缺乏症会使病鸡角弓反张呈观星姿势，神经痉挛，体温下降。

1.2 MS 的分离鉴定

无论是活禽还是死禽，若需运输，应在采集完病料加入冰袋或其他制冷措施保持低温［20］。将病鸡解剖，取病料（喉头、气管、关节液、气囊等）与PBS 缓冲液混合后破碎离心，取上清液过滤到液体培养基中，37 ℃温箱培养3～5 d，观察生长情况，若培养基颜色变黄无浑浊沉淀，则说明生长情况良好，可以将菌液涂布在固体培养基培养3～5 d，显微镜下观察菌落状态是否为煎蛋样。这种方法比较费时费力，对营养要求也比较高，虽准确，但不利于快速检测。

1.3 血清学方法

MS 的血清学诊断方法有平板凝集试验（SPA）、血凝抑制试验（HI）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等。平板凝集试验（SPA）可以用于MS 感染早期的检测，主要检测IgM 抗体，这种检测方法成本低、操作快捷、反应灵敏，缺点是非特异性反应较强，准确率有待提高。血凝抑制试验（HI）是指利用血清中的抗凝集抗体与抗原结合而导致血凝被抑制的现象，主要检测IgM 抗体，这种检测方法特异性较好，但必须注意抗原的选择和制备，所以比较费时，灵敏性也较低［21］。

MS 的商品化ELISA 检测试剂盒以检测抗体为主，如Synbiotics 公司的禽败血/滑液囊支原体ELISA抗体检测试剂盒、江西江蓝纯生物试剂有限公司的鸡滑液囊支原体抗体（MS-Ab）ELISA 试剂盒等，这些试剂盒主要是以血凝素vlhA 蛋白为抗原检测抗体。除此之外，温政［22］制备并鉴定了LP78 蛋白单克隆抗体，选用的LP78 是一种免疫原性很强的膜蛋白。刘晓涵等［23］制备了滑液囊支原体NADH 氧化酶（NADH oxidase，NOX）的单克隆抗体。连丽燕等［24］对MS 糖酵解的关键酶磷酸丙糖异构酶（Tpi）和丙酮酸激酶（PK）的研究也为后续制备抗体提供了参考。ELISA 检测效率高、灵敏度高、特异性好，适合大量样品的检测，也可用于卵黄抗体的检测。综合来看，间接ELISA 灵敏度不如SPA，特异性不如HI。以上3 种方法都不能做到完全的准确，可以选择不同的方法综合验证，初步筛选时可以选择间接ELISA 或者SPA，复检时可用HI。

1.4 分子生物学方法

分子生物学方法操作相对简单，可以直接检测样品中MS 的核酸，结果准确率较高，但也有可能存在一定比例的假阳性和假阴性。常用于检测MS 的分子生物学方法主要为聚合酶链式反应（PCR）和荧光定量PCR（qPCR）［25］，微滴式数字PCR（ddPCR）和等温扩增技术（ITA）是新技术，在临床应用上还较少。

PCR 鉴定是实验室鉴定MS 常用的分子生物学方法，通过扩增MS 特异性的16S rRNA 片段或vlhA基因即可快速检测，对比分离培养，PCR 鉴定更加快速可靠，便捷灵敏。荧光定量PCR 技术在MS 诊断方面已经有了很大的发展，比普通PCR 有更高的灵敏度和特异性［26］。徐彬等［27］在鉴定出的17 个MS特有基因中选取了保守基因VY93_RS02885作为标靶基因，建立了SYBR green qPCR 检测方法，结果表明该方法准确性高、可重复性强。已有商品化的MS荧光定量PCR 检测试剂盒，如IDEXX 公司的RealPCR MS DNA 检测预混液、上海炎熙生物科技有限公司的探针法滑液支原体实时定量PCR 试剂盒。此外，韩勇等［28］针对鸡毒支原体的pvpA基因和滑液囊支原体的vlhA基因建立了TaqMan-MGB 双重荧光定量PCR 检测方法，结果与商品荧光PCR 试剂盒的符合率达100%。

数字PCR 是在荧光定量PCR 之后发展起来的核酸定量分析技术，先将反应体系均分到大量独立的微反应单元中，然后再进行PCR 扩增，最后根据泊松分布原理和阳性微滴的个数与比例计算核酸拷贝数实现定量分析［29］。谢志勤等［30］针对vlhA基因的保守区域建立了ddPCR 检测方法，验证后发现这种方法特异性强、敏感性好，为绝对定量MS 提供了合适的技术。等温扩增技术（ITA）是基于恒温扩增的新型核酸扩增技术，主要包括环介导等温扩增技术（LAMP）、交叉引物扩增技术（CPA）、重组酶介导等温扩增技术（RAA）和依赖核酸序列扩增技术（NASBA）等［31］。寇艳利［32］基于MS 基因编码区序列设计引物后建立了LAMP 检测方法，试验证实有较好的敏感性和特异性。卞红春等［33］基于vlhA基因保守序列建立了RAA 检测方法，不需要昂贵设备，有望应用于基层实验室。

2 饲养管理

预防MS 首先需要提高鸡场的管理水平和饲养人员的生物安全意识。应定期培训、讲解MS 以及其他传染疫病的防控要点。人员需严格遵守进出及消毒程序，注意灭鼠防蚊虫，防飞禽进入，及时清理排泄物，减少应激因素，密切观察鸡群状态［34］。鸡群饲养密度不宜过大，确保栋舍通风良好，减少尘埃颗粒悬浮时间，温度湿度适宜，为鸡群建造一个干净适宜的生长环境［35］。同时把控饲喂流程的各方面，场区实行全进全出，不同批次分开饲养。进行种源进化，建立纯净的鸡群是防控MS 最好的方法［36］。鸡群一旦发生垂直传播，传播范围变大，损失也将更大，发现MS 症状应第一时间隔离诊断。在减抗限抗的背景下，治疗用药时可以减少抗生素的使用，加入黄芪多糖、维生素、微生物制剂等添加剂，提高鸡群免疫力。也可以在预防MS 时在饲料中添加中药，增强鸡群体质，抵御外邪。整个MS 发病过程中，肝、肾2 个脏器很重要，可以选用淫羊藿、益母草、黄芪、当归和女贞子等补肝益肾的药物［37］。

3 疫苗接种

接种疫苗可以有效降低鸡群的发病率，控制传播范围，在条件允许的情况下，应该提前接种，国内外学者对MS 疫苗展开了研究，使用的疫苗主要是弱毒活疫苗和灭活疫苗［38］。鸡滑液囊支原体弱毒活疫苗有MS-H 株和MS1 株。MS1 株弱毒疫苗是体外传代培养突变得来，但该疫苗在中国未注册［39］。弱毒活疫苗主要有MS-H 株，该疫苗株分离自澳大利亚，2017 年在中国注册，MS-H 株对温度敏感，需要在合适的温度下运输，解冻后2 h 内要完成接种。MS-H 株弱毒活疫苗可采用点眼和喷雾两种方法接种，以点眼为主。经过评估，该疫苗可以有效地减轻MS 的临床症状，安全系数较高，MS-H 株弱毒活疫苗运输保存条件苛刻，免疫要求高，中国的鸡群大部分是MS 阳性鸡群，也不利于鸡群的净化，所以该疫苗在中国应谨慎使用［40］。国内注册的灭活疫苗有青岛易邦生物工程有限公司的鸡滑液支原体灭活疫苗（YBF-MS1 株），该疫苗颈部皮下注射21 日龄及以上的鸡，种鸡和商品蛋鸡可以在开产前一个月加强免疫一次，屠宰前21 d 禁止使用，禁止冷冻，体质瘦弱的鸡禁止使用，接种后28 d 产生免疫力，免疫期为6 个月。也有其他灭活疫苗被学者评估过，例如鸡滑液囊支原体WVU1853株和鸡滑液囊支原体CHNJ2-2016 株［41］。灭活疫苗可以刺激鸡机体产生良好的免疫反应，降低MS 的感染率，接种灭活疫苗后需要评估鸡群的生产性能，同时还要选择合适的佐剂。除上述之外，基因工程疫苗因为安全性高、生产成本低，已经成为疫苗研究的主要方向。宋春等［42］对MS 贵州株的膜蛋白EF-Tu、pdhβ 进行了免疫原性分析，EF-Tu、pdhβ 重组蛋白都可以与MS 阳性血清发生特异性结合。刘佳等［43］对MS WVU1853株的dnaK基因进行了原核表达，间接ELISA 和Western-blot 的结果表明，rMSDnaK 具有良好的免疫原性，为进一步研究MS DnaK 的生物学功能奠定了基础。

4 药物治疗

疫苗接种效果有限，所以药物治疗也是防控MS的重要手段。该病遵循早发现、早治疗的原则［44］，密切观察鸡群，发病后，如果有症状严重的一定要及时淘汰，无害化处理，症状较轻的及时药物治疗控制传播［45］，对该病敏感有效的药物有泰乐菌素、泰妙菌素、泰万菌素、林可霉素、强力霉素、土霉素、四环素、万古霉素和恩诺沙星等［46］。药物治疗时不建议大剂量和长期用药，同时应该选用穿透力较强、敏感度较高的药物［47］。张辉等［48］选用了中药复方治疗MS，以泰乐菌素作为对照，结果发现中药组效果明显优于对照组。张孝宁［49］研究了芩苓汤对滑液囊支原体病的治疗作用，发现芩苓汤可以显著降低IL-6、IL-8、TNF-αm RNA 的相对表达量，治愈率达53.3%，有效率达66.7%，对滑液囊支原体病有良好的治疗效果。

5 展望

滑液囊支原体（MS）感染在全国范围内的流行日趋严重，给中国养殖业造成较大的损失，对MS 的防控是长期和艰巨的任务，需要研发更加精准、快速、便捷的MS 诊断方法，加强监测，从源头控制MS的传播。已有药物预防与治疗的方法很多，但缺乏科学规范系统的综合防控措施，疫苗和药物的使用也缺乏科学的指导，导致的免疫效率低、耐药、药物残留等问题不容忽视。研发更安全有效的MS 疫苗，筛选研制针对性更强的抗生素及中草药替抗药物迫在眉睫。