黄芪多糖对新城疫活疫苗免疫增强的作用

汪宏才，商 雨，温国元，任项霏，罗 玲，张蓉蓉，曾 哲，徐英英，罗青平

（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430064；2.农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室，武汉 430064；3.畜禽病原微生物学湖北重点实验室，武汉 430064）

黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是黄芪根部主要活性成分，具有免疫调节、抗氧化、抗炎等生物活性［1，2］。APS 属于药用植物多糖，无毒、无副作用［3］，在中医领域有着广泛的应用。天然多糖具有良好的免疫促进作用，同时能提高体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫［4］。APS 是乙型肝炎DNA 疫苗的有效佐剂，可以通过促进树突状细胞（DC）成熟和抑制调节性T 细胞（Treg）频率来增强乙型肝炎DNA 疫苗的免疫反应［5］。在兽医方面APS 的应用也逐渐增多，Abdullahi 等［6］证实口服APS 可以改善免疫反应方面的潜力，可用作H5N1 疫苗的佐剂。SHAN 等［7］认为口服APS 可以增强鸡的肠黏膜免疫功能，可作为疫苗增强剂。薛力刚［8］通过将黄芪多糖联合新城疫疫苗进行胚胎免疫，证明了APS 可以促进了雏鸡早期生长发育，并且可以增强了ND 疫苗的免疫效果。国内外学者将APS 应用于提高ND 疫苗的免疫方面［9，10］，并且取得了良好的效果。APS 在新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）La Sota 方面的应用较多，大多采用口服、饮水或注射的方式，在免疫前或免疫后分开使用APS，而APS 在NDV V4 株和HB92 株［11］方面的应用鲜见报道。由于V4 株是一种耐热嗜肠道病毒，具有良好的黏膜免疫和细胞免疫特性。本研究将APS 作为ND V4 和HB92 株活疫苗的免疫增强剂，通过滴鼻点眼的方式进行免疫接种，检验抗体滴度和疫苗保护率，评价疫苗的保护效果，为APS 在新城疫活疫苗在不同免疫途径方面的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

NDV V4 株、NDV HB92 株由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所禽病团队实验室保存。鸡NDV 北京株（CVCC AV1611），购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。黄芪多糖粉购自北京索莱宝科技有限公司（批号616G021）。NDV HI 抗原，购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。SPF 鸡胚购于北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。1%鸡红细胞，实验室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 病毒传代 将NDV V4 株、HB92 株分别在SPF 鸡胚上传代1～3 代，选择HA 血凝效价达到8log2 的尿囊液，-80 ℃保存备用。

1.2.2 毒价测定 将含毒尿囊液使用PBS 进行10倍梯度稀释至10-9，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95 个稀释度，每个稀释度通过尿囊腔接种5 枚9～10 日龄SPF 鸡胚，每胚接种0.1 mL，观察120 h，逐胚测定尿囊液HA 效价，以HA≥7log2 判定为感染，按照Reed-Muench 法计算病毒EID50。

1.2.3 抗原配制 按照参考文献［9］的方法配制APS 溶液。将APS 用PBS 溶解后，使最终APS 含量为0.5%。根据试验分组，用APS 溶液稀释NDV 至104.0EID50/0.1 mL，4 ℃冷藏备用。

1.2.4 试验分组 将50 羽试验鸡平均分为5 组，每组10 羽。4 个免疫组接种剂量同为104.0EID50，第1组用PBS 稀释V4 株，第2 组用APS 溶液稀释V4 株；第3 组用PBS 稀释HB92 株，第4 组用APS 溶液稀释HB92株；第5组为空白对照组。具体分组信息见表1。

表1 试验分组

1.2.5 动物试验 雏鸡饲养至30 日龄，并于7、30 d随机选取5 羽雏鸡，采集血液分离血清，检测母源抗体。按照分组，V4 株和HB92 株采用滴鼻点眼的方式，接种30 日龄雏鸡，并于免疫后7、14 d 分别采血检测血凝抗体，14 d 后连同对照组肌肉注射104.0ELD50（0.1 mL）北京强毒株，观察14 d，统计发病死亡数量，计算保护率。对照组应全部死亡，免疫组保护率达到90%为合格。

2 结果与分析

2.1 病毒毒价测定结果

将冻干的NDV V4 株和HB92 株，通过SPF 鸡胚复苏后，测定EID50。结果发现，V4 株和HB92 株病毒毒价分别为108.7EID50/0.1 mL 和107.9EID50/0.1 mL（表2）。

2.2 抗体检测

使用微量法血凝抑制试验（HI），检测免疫前母源抗体、7 日龄和14 日龄抗体。结果显示，免疫前母源抗体全部降至2log2 以下，符合试验要求。7 日龄时，V4+APS 组显著高于V4 组，但均低于4Log2；HB92+APS 组低于HB92 组（图1）。免疫14 d，HB92组和HB92+APS 组抗体均超过4Log2，且添加APS 的免疫组抗体显著高于未添加APS 组（P＜0.05）（图2）。

2.3 攻毒保护

免疫14 d，连同对照组肌肉注射104.0ELD50北京强毒株，对照组鸡全部死亡，保护率为0，V4 免疫组保护率为70%，其余3 个免疫组保护率为100%（表3）。试验鸡的死亡高峰集中在攻毒后3～5 d（图3），添加APS 的试验鸡能有效抵抗强毒的攻击。

表3 NDV 攻毒保护

3 小结

APS 作为免疫保护剂，在兽医上已有广泛的应用。在家禽方面，主要用于提高疫苗的免疫效果，在免疫的同时注射APS，提高体液免疫。低剂量黄芪多糖可显著提升ND 抗体滴度，有显著的免疫增强功能［12，13］。采用皮下注射APS 方式，抗体产生早、抗体持续时间长、效价高，对疫苗免疫有很强的辅助效果［14，15］。在细胞免疫和黏膜免疫方面，APS 还可以促进细胞免疫功能［16-18］。

不同疫苗毒株、不同的免疫途径，免疫效果存在显著差异。本试验采取滴鼻点眼的传统方式进行免疫，符合国内大多数养殖场采用的免疫方法。滴鼻点眼免疫途径可有效刺激黏膜免疫［15，17，19］和体液免疫［20］。APS 不仅可以作为免疫增强剂，还可以作为疫苗冻干保护剂，减少冻干过程中的抗原损失。APS 还是一种具有免疫调节作用的中草药绿色饲料添加剂，有显著提高动物免疫功能的作用［21］。

《中华人民共和国兽药典》规定，ND 活疫苗的免疫剂量不低于106.0EID50/羽份，本试验采取104.0EID50作为免疫剂量，旨在最小免疫剂量检验V4 和HB92这2 个疫苗株的免疫效果。抗体水平的高低，是评价疫苗免疫效果的一种简单、常用的方法，在临床上经常使用，但这仅反映了体液免疫情况，而没有客观反映黏膜免疫和细胞免疫效果。

本试验通过强毒攻击试验，结合免疫后抗体检测，从客观上反映了ND 活疫苗的综合免疫效果，证明APS 对于ND V4 株活疫苗、HB92 株活疫苗具有显著的免疫增强作用，能够有效抵抗ND 强毒的感染，保护率达到100%，为V4 株和HB92 株ND 活疫苗的临床应用提供了一种新的途径。