植物中Ca2+生理功能的研究进展

张鹏飞，王立峰，刘倩倩，张小娟，凌 冬

（襄阳市农业科学院，湖北 襄阳 441057）

微量Ca2+可以拮抗Na+并对维持蛙心肌收缩更有效［1］。Ca2+是细胞中的第二信使，在植物中Ca2+有调节膜透性的功能，可促进细胞间的黏合和胞间通讯，并且调节细胞分裂［2］。Ca2+在各种不同功能的细胞中具有严格的、复杂的空间分布。钙能够在植物的各种生理活动中起作用，主要通过细胞质Ca2+空间和浓度的瞬时变化来实现［3］。Ca2+不同的存在形式、不同的分布位置、不同的转运通道、不同的受体蛋白在调控植物的生长发育、响应外界环境变化、传递细胞信号、调控基因表达及影响蛋白构象等各方面均可发挥重要作用。

1 Ca2+在植物中存在的形式

植物细胞内所有的钙称为总钙，可分为游离钙、结合钙和贮存钙3 种形式，总含量约0.1-10mmol/L，3 种形式的钙通过时间和空间上浓度的变化来影响细胞各种功能的发挥，不同状态各种形式的钙离子浓度不同，称为钙指纹［4］。细胞中钙信号主要是通过自由状态存在的游离钙来实现的，一般低于10-6mol/L；结合钙是Ca2+和草酸根、磷酸根及碳酸根等结合成不易释放钙离子的草酸钙、磷酸钙和碳酸钙等，可作为营养物质和结构物质存在；贮存钙，较结合钙与结合物的亲和力弱，结合不紧密，可从结合物或储存位置中转换成其他形式的钙或被转运到细胞的其他部位，含量在10-6mol/L 以上，常位于胞内钙库内质网和胞外钙库细胞壁中［5，6］。

2 Ca2+在植物中的分布

生物膜系统和细胞质中Ca2+分布不均匀，静止状态Ca2+浓度梯度是Ca2+信号产生的基础，植物在受到刺激时Ca2+发生变化并使信息传导到下游的信号物质中。通过生物膜系统把Ca2+的储存区域化，可分为胞内钙库和胞外钙库。胞内钙库是指细胞内储存Ca2+的细胞器，如液泡等；胞外钙库是指细胞外储存Ca2+的场所，如细胞间隙和细胞壁［7］。液泡是最大的胞内钙库，其中游离Ca2+水平估计在10-3mol/L，内质网中Ca2+浓度约为10-6mol/L［8］。质体和线粒体中Ca2+浓度同样高于细胞质中Ca2+的浓度，这主要是由于光合作用和呼吸作用引起的膜电位平衡所致［9］。

3 Ca2+在植物中的转运

钙信号主要是通过调节植物内不同部位Ca2+浓度来进行。植物通过感受不同的胁迫激活不同的Ca2+通道调节其浓度产生特异性信号，进而引起一系列生理反应。

3.1 Ca2+内流通道

Ca2+内流通道根据激活方式主要可分为电压依赖型和配体激活型［10］。电压依赖型Ca2+通道因质膜或细胞内膜两侧电压迅速变化而快速响应外界刺激，并在短时间瞬时提高胞内Ca2+浓度；配体激活型钙离子通道则更多依赖于其他信号分子，如环化单磷酸腺苷（Cyclic nucleotide gated channels，CNGCs）和谷氨酸受体通道（Glutamate receptors，GLRs）等，这类钙离子通道需要相应的激活物调控细胞外的Ca2+流入细胞质，进而介导细胞质内Ca2+浓度升高［11］。

3.1.1 电压依赖型钙离子内流通道 质膜上的电压依赖型Ca2+通道根据质膜极化方式不同可分为去极化激活的钙离子通道和超极化激活的钙离子通道［12］。质膜上的去极化激活的Ca2+通道由阳离子内流引起的质膜去极化而被激活；液泡膜的电压依赖型Ca2+通道属于慢型液泡钙离子通道，该类Ca2+通道在去极化下被激活，而在静息状态或超极化下失活［13］。

3.1.2 配体激活型钙离子通道 配体激活型Ca2+通道，主要是环式核苷酸门控通道（CNGC），植物CNGCs 对离子的选择性较低，既可通过Na+、K+等一价阳离子，也可通过Ca2+等二价阳离子。拟南芥CNGCs家族有20 个基因（CNGC1-CNGC20），定位在不同的组织和器官中，参与调控植物生长发育及应答生物与非生物胁迫等［14］。大麦糊粉层中首次克隆到植物CNGC基因HvCBT1，该基因编码702 个氨基酸，蛋白结构域包含CaM 结合域和环核苷酸结合域，其中环核苷酸结合位点位于C 端，该位点可被环核苷酸和钙调素竞争激活，当结合钙调素后，该通道被关闭［15］。拟南芥的CNGC18转入大肠杆菌（Escherichia.coli）中发现，Ca2+内流明显增多［16］；以CNGC5、CNGC6、CNGC9和CNGC12为主的多个CNGC家族成员在气孔保卫细胞中表达动态形成气孔保卫细胞质膜Ca2+通道，并负责Ca2+信号的产生和调控；其转基因株系CNGC6-DN1、CNGC6-DN2和CNGC6-DEL中观察到ABA 不能有效驱动气孔关闭也不能抑制光诱导气孔开放的表型，且其离体叶片的失水萎蔫速度明显快于野生型，这4 个CNGCs 共同组成一类ABA 激活的质膜Ca2+通道，其功能缺失导致气孔保卫细胞质Ca2+信号紊乱，从而抑制ABA对气孔的调控作用［17］。

3.2 Ca2+外流通道

高浓度的细胞Ca2+可能对细胞有毒害作用，NbCA1 是定位在烟草内质网的Ca2+-ATPase，沉默的NbCA1导致细胞液和细胞核内的Ca2+浓度异常，可能导致细胞凋亡［18］。质膜间快速的钙离子外流在信号响应过程中扮演着非常重要的角色，植物细胞内Ca2+外流通道主要有Ca2+-ATPase 和Ca2+/H+反向运输通道（Ca2+/H+exchanger antiporter，CAX）［19］。

3.2.1 Ca2+-ATPase 外流通道 Ca2+-ATPase 对细胞中钙离子的稳定状态起重要的作用，它担负着细胞内外钙离子的交换功能，使得胞外和胞内钙离子浓度维持在正常水平［20］。植物中的Ca2+-ATPase 可分为PⅡA-ATPase 或内质网型-ATPase（ER-type calcium ATPase，ECA）和PⅡB-ATPase，PⅡB- ATPase由于受自身N 端自我抑制又称为自动抑制Ca2+-ATPase（Auto inhibited calcium ATPase，ACA）［21］，其主要区别是组成这2 种类型的Ca2+-ATPase 的氨基酸序列不同［22］。在不同植物的不同组织，不同细胞和不同亚细胞中Ca2+-ATPase 的分布和活性也各不相同。Ca2+-ATPase 主要分布在液泡膜、内质网、叶绿体和线粒体等细胞器中［23］。2 个钙调素蛋白（Calmodulin，CaM）可结合到Ca2+-ATPase 上一起发挥功能，阻止钙离子通过，通过Ca2+与其C 端和N端的结合实现对Ca2+-ATPase 活性的调节。Ca2+-ATPase 可以精确测量细胞中Ca2+的浓度，通过开启和关闭流通通道调控Ca2+在细胞中的浓度及转运速度［24］。在拟南芥中已经克隆出4 个ECAs家族基因，主要分布于内质网（ECA1）和高尔基体（ECA3）；其他10 个ACA基因家族分布于细胞内各类生物膜上［25］。

3.2.2 Ca2+/H+反向运输通道 Ca2+/H+反向运输通道在植物细胞质膜和液泡膜上均有分布，CAX 是1种低亲和高效运输通道，Ca2+浓度较高时发挥作用［26］。拟南芥中6 个CAX基因参与维持植物内Ca2+水平，敲除AtCAX和AtCAX3能提高拟南芥对Ca2+的敏感度，导致生长缓慢［27］。在拟南芥发芽期AtCAX1和AtCAX3通过调控质膜H+-ATPase 抑制H+外流影响植物细胞生长素的运输，提高ABA 的敏感度，导致气孔开度降低，而将AtCAX1转入水稻可以提高胚乳的Ca2+浓度，从而调节水稻的产量水平［28］。

4 钙信号感受蛋白

将钙信号传递至下游相应的受体是植物产生生物学功能的重要步骤，钙信号通过下游钙靶蛋白进行信号转导［29］。钙靶蛋白又可通过下游级联不同的其他靶蛋白作出相应的控制和调控［30］。钙的靶蛋白主要可分为钙调素蛋白（CaM）、类钙调素（CaM-like proteins，CML）、钙依赖蛋白激酶CDPK和类钙调磷酸酶B蛋白（Calcineurin B-like protein，CBL）4 大类。

4.1 钙调素蛋白

CaM 含有4 个EF 手型结构域，哑铃状、酸性的蛋白分子，在大多数植物中都存在，可做第一和第二信使［31］。可单独行使功能，也可与Ca2+结合形成复合体与下游的靶蛋白相互作用［32］。在脊椎动物中不同的CaM 基因编码同样的CaM 序列，而在植物中不同的CaM 基因编码相同或相似的CaM 蛋白序列，这种相似的CaM 都具有EF 手型结果［33］。不同亚型在不同的生长和发育阶段和不同的组织中起不同的作用，应答不同的信号，作用于不同的靶蛋白，完成不同的生物学功能。不同亚型的CaM 增强了Ca2+信号网络的多样性和复杂性［34，35］。拟南芥中CaM 与其结合蛋白IQM5 形成1 个复合体CaM-IQM，该复合体是调控生长素诱导愈伤组织和侧根形成的重要因子，IQM 显性负突变体可显著抑制愈伤组织的形成［36］。

4.2 类钙调素蛋白

CML 家族也包含高度保守的2～4 个EF 手型结构域，与CaM 有高度同源性，是植物特有的一类蛋白［37］。CML42 有3 个Ca2+结合位点，1 个在N 端，2个在C 端；其中2 个结合位点与CaM 相似，推测第3个结合位点在静息状态下可能一直结合Ca2+［38］。拟南芥的花粉中至少有18 个CML基因表达，其中CML2、3、6、15、25、28、29、39和49是组织特异性表达［39］。拟南芥受到病菌侵染后CML9最先表达，这可能与其编码抗病信号网络有关，其表达由植物病原菌、鞭毛蛋白和水杨酸快速诱导并参与植物防御［40］。CML42定位于细胞质和细胞核中，在生物胁迫和非生物胁迫中作为钙离子的传感器负调控茉莉酸（JA）信号通路，同时参与调控ABA 信号网络［41］。CML24和CML25功能敲除的突变体中，花粉粒萌发、花粉管生长及种子结实率均受到抑制；同时突变体中花粉粒和花粉管中的细胞质Ca2+浓度均增加，推测CML25可能通过调节依赖Ca2+的K+流动而在花粉萌发和生长中发挥作用［42］。在橡胶树的研究中发现，HbCML27的表达受乙烯利（ETH）和JA 诱导，可能参与了调控橡胶树产排胶过程［43］。甘蓝中BoCML49基因表达量在花粉萌发后迅速下降，并维持在一定水平，可能引起花粉管的伸长［44］。结球甘蓝的BoCML39基因对逆境胁迫、活性氧的响应比较灵敏，且不同处理均能上调叶和根中BoCML39的表达水平，该基因可能在不同器官中感受不同信号模式的诱导［45］。

4.3 钙依赖蛋白质激酶

钙依赖蛋白激酶（Calcium-dependent Protein Kinase，CDPK/CPK）可能是由CaM 进化而来，CDPK 为单肽链，该链包括4 个结构域，1 个是N 端可变结构域，1 个是蛋白激酶催化结构域，1 个是包含1 个钙调素结合位点的自抑制结构域和1 个C 端钙调素类似结构域［46］。N 端可变结构域的保守性最差，不仅氨基酸的序列不同，而且氨基酸的数目也在一定范围内变动，功能了解较少，可能涉及亚细胞靶向信息；蛋白激酶催化结构域比较保守，在拟南芥中34 条CDPKs 催化结构域活性位点100%保守；自抑制结构域位于C 端与CaM 类似区之间，由20～30 个富含碱性氨基酸组成的保守序列，当游离Ca2+浓度较低时，该结构域被抑制并使CDPK 的活性降低，而当游离Ca2+浓度达到一定信号值时Ca2+结合到钙调素类似区的EF 手型结构域，使CDPK 整个构象发生改变，自抑制被解除［47］。

大部分CDPK 是植物和原生动物中接受Ca2+调控的最大的蛋白激酶家族，其功能需要进一步深入的研究和探索［48，49］。CDPK 参与碳代谢、细胞骨架的组织排布、氮代谢、抗病反应、植物育性、基因转录和离子转运等［50］。如大豆中1 个CDPK 与肌动蛋白（F-acting）共定位在细胞分裂中期的细胞骨架上，可能参与细胞骨架的重新排列和组织［51］。肌动蛋白解聚因子能够被Ca2+依赖的蛋白激酶磷酸化，玉米中的ZmADF3Ser-6被Asp 代替使得ZmADF3 不能结合G-或者F-actin，导致肌动蛋白不能解聚［52］。水稻中一些CDPK 特异性在增殖细胞表达，胚乳及未成熟的种子中也有部分CDPK（SPK）专一性表达，水稻种子中沉默了胚乳特异性的CDPK 使得种子淀粉积累被破坏［53］。CPK4 和CPK11 及CDPK11 和CDPK24 互作，分别参与了依赖ABA 或MAPK 途径的种子发育、气孔运动和花粉发育等生理过程［54］。水稻中ABA 处理能够抑制水稻胚芽鞘的伸长，同时也下调水稻CDPK cDNA（OsCDPK11）转录表达［55］。OsCPK12突变体可导致叶片的过早衰老，其过量表达导致生育期延迟［56］。在拟南芥中CPK4、5、6 和11诱导了对MAMP 识别的快速转录调控；CPK4、5 和11 已被证明在体外可磷酸化WRKY8、28 和48，并可对转录因子活性直接进行翻译后调节［57］。高浓度的锰胁迫会激发Ca2+信号，并激活Ca2+感受器CPKs家族中的CPK4/5/6/11，CPKs 与定位于液泡膜的锰转运体MTP8 物理互作，并通过磷酸化MTP8 的第31位和32 位丝氨酸激活其转运活性，最终将细胞质中多余锰离子转运进液泡内，提高植物耐受锰毒害的能力［58］。拟南芥中定位于细胞质膜的CPK28基因受低温诱导表达显著，转录因子NLP7 和CPK28 存在同1 个蛋白复合体中，CPK28 磷酸化NLP7 并促进NLP7 从细胞膜转移至细胞核中，NLP7 调控大量冷响应基因的表达。同时NLP7 是植物响应氮信号的关键转录因子，CPK10、CPK30 和CPK32 在细胞核中磷酸化NLP7 的第205 位Ser，使NLP7 在细胞核中滞留，进而激活氮应答基因的表达，低温可激活的CPK28 磷酸化NLP7 的第783、793、807、808 位Ser 和第817 位Thr，促进细胞质定位的NLP7 迁移至细胞核中。氮信号和低温信号会通过不同的CPK 蛋白磷酸化NLP7 不同的氨基酸残基，从而使植物作出正确的应答［59］。

4.4 钙调磷酸酶B类似蛋白

钙调磷酸酶B类似蛋白（Calcineurin-B like protein，CBL）是一类比较小的Ca2+结合蛋白，它们属于CaM 超家族，也有典型的4 个EF 手型结构域，但不清楚其所含的EF 手型结构域是否在每1 个CBL 蛋白中都有明确的生物功能［60］。CBL 结合Ca2+后，与钙调磷酸酶互作蛋白激酶（CBL inter acting protein kinase，CIPK）相互作用，CIPK 被激活传递钙信号［61］。对拟南芥中10 个基因编码CBLs 和25 个基因编码CIPKs 的定位分析表明，拟南芥有4种CBL位于质膜，4 种位于液泡膜，2种位于胞质和细胞核中［62］。SOS3 是CBLs 的1 个成员，它可以活化SOS2蛋白激酶，SOS2 可以分别调节质膜和液泡膜Na+/H+反向运载体SOS1 和AtNHX1，这些与植物抗逆关系密切［63］。CBL4-CIPK24 复合物通过调控位于质膜上的H+/Na+反向运输蛋白SOS1 调节Na+外流，而CBL10-CIPK24 也可以调节液泡的Na+运输［64］。CBL 和CIPK 提供了大量的理论组合对，同时CBLCIPKs 靶目标也具有多样性，这为钙信号的传达提供了灵活性和调控方式的多样性。

5 Ca2+在花粉败育中的作用

植物的杂种优势和雄性不育涉及广泛，为对其遗传和分子机理更好地揭示和更加有效地利用，对花粉败育相关的通路研究和探讨十分必要。Ca2+在小孢子败育过程中扮演着重要的角色。利用荧光标记研究小孢子发育、花粉萌发过程中Ca2+和CAM 的分布，发现Ca2+与小孢子发育过程有丝分裂、胼胝质合成及花粉管的伸长有关，同时绒毡层细胞可能通过乌氏体向小孢子转运Ca2+［65］。研究Ca2+定位可应用焦锑酸盐沉淀技术，该技术在小孢子生长发育及雄性不育的研究中广泛应用［66］。营养细胞和生殖细胞的特异性发育依赖细胞中不同浓度的Ca2+调节和控制［67］。运用焦锑酸盐沉淀技术，研究光敏核不育水稻发现，在可育花药发育的过程中，大量的Ca2+沉淀在花药壁和花粉粒表面，乌氏体在小孢子发育的后期携带大量的Ca2+，但在花粉粒的细胞质中没有Ca2+被焦锑酸钾沉淀，有丝分裂时才能检测到Ca2+，随着淀粉粒在花粉中的积累，Ca2+在花粉壁中的沉积开始消失，但在连接组织中的Ca2+在增加；在不育花药中，Ca2+大量的存在小孢子中层和药室内壁中，绒毡层中却没有Ca2+被检测到，并且在花药壁中Ca2+的积累也很少。推测不同发育时期Ca2+在不同组织中的不同浓度可能与光敏不育系的育性相关［68］。在研究小麦小孢子发育和Ca2+分布间的关系时发现，Ca2+可能与乌氏体协同运输［69］。不育系珍汕97A 与其保持系珍汕97B 的Ca2+的积累过程中发现，不育系中，绒毡层异常解体，并且其分泌形成的乌氏体较少，在形成的乌氏体上Ca2+的定位也较少［70］。在光敏感核不育水稻花粉育性与Ca2+分布的相关性中发现，在花粉壁形成的过程中，不育系中形成缺陷花粉壁中Ca2+的分布较少；不育系形成乌氏体早于可育系，但形成的乌氏体无明显的Ca2+沉淀分布。这种异常形成的乌氏体以及Ca2+的异常分布和运输可能导致花粉败育［71］。

6 小结

Ca2+是一种普遍存在的第二信使，将环境信号与植物细胞反应联系起来，其分布、定位、转运及下游受体对分析Ca2+信号网络至关重要。由于钙信号可能会由于细胞膜局部内流通道和细胞器特异性流出通道的相互作用而变得复杂，不易被精确测量。钙信号起始、传导、交联通路，Ca2+、ABA、H2O2等不同信号通路间的相互作用，Ca2+通道精确定位、功能精确解析、转运、调控机理将成为未来的研究热点。