时间:2024-05-25
石丽娟
摘要:鸡马立克氏病是由疱疹病毒引起的鸡的一种淋巴细胞增生性、高度接触性传染病。利用解剖学、组织学、血清学和病毒学检查对疑似鸡马立克氏病进行了诊断。
关键词:鸡马立克氏病;诊断;防治
中图分类号:S858.31 文献标识码:B 文章编号:1007-273X(2014)12-0014-03
马立克氏病(Mareks disease,MD)是由马立克氏病疱疹病毒引起的传染性肿瘤性疾病,是最常见的一种鸡淋巴组织增生性传染病[1]。以外周神经包括虹膜、皮肤在内的各种器官和组织的单核性细胞浸润为特征[2]。马立克氏病对1日龄雏鸡最易感染,2~18周龄鸡均可发病。母鸡比公鸡易感性高。潜伏期常为3~4周,一般在50日龄以后出现症状,70日龄后陆续出现死亡,90日龄以后达到高峰,偶见3~4周龄的幼龄鸡和60周龄的老龄鸡发病。该病的发病率变化很大,一般肉鸡为20%~30%,个别达60%;产蛋鸡为10%~15%,严重达50%,死亡率与之相当。MD 存在于世界上所有养禽国家和地区,随着养鸡业的集约化程度的提高,其危害增大,受害鸡群的损失可高达50%以上。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 病料 丹东市某地区某农户送检的病死鸡30只,雏鸡20只。
1.1.2 试剂 MD阳性血清、MD沉淀抗原、甲醛、乙醇(95%)、二甲苯、石蜡、甘油、苏木素、钾明矾、曙红、NACL。
(1)阳性血清的制备:用已知的标准MD抗原与鸡群中慢性病鸡或康复鸡的血清做琼脂凝胶试验,如出现清晰的沉淀线,则为MD阳性血清。采血分离血清加0.01%硫柳汞防腐,冻结保存备用。
(2)琼脂平板制备:用含8%NaCL的硝酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH7.4)配制1%琼脂糖,水浴加热使琼脂糖充分溶解,多层纱布过滤,将无菌平皿(直径9 cm)置水平台上,每个平皿倒入融化的琼脂糖约15~20 mL[13]。使其厚度为2.5~3.0 mm。注意倾倒时勿产生气泡,置4 ℃冰箱中保存备用。
在已制备的琼脂板上,用打孔器按六角形图案打孔,或用梅花形打孔器。中央打1个孔,孔径4 mm,周围打6个孔,孔径3 mm,中央孔与周围孔孔距为3 mm。将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插入,轻轻向左侧方向挑出,勿损坏孔的边缘,避免琼脂层脱离平皿底部[14]。将平皿底部置80~90 ℃水浴中旋转数秒钟,或放在酒精灯火焰上缓缓加热,微微烫即可。使孔底边缘的琼脂少许熔化以封底,以免加样后液体从孔底渗漏。
1.1.3 仪器 显微镜、电热恒温培养箱(DHG-9053A型)、切片机、水浴锅、座式自动电热压力蒸汽灭菌器、微量移液器、电炉、平皿、架盘药物天平、砝码、药匙、量筒、烧杯、玻璃棒、纱布、漏斗、毛刷、剪子、手术刀、镊子、载玻片、盖玻片、木块、废液缸、酒精灯、滤纸、树胶、新鲜蛋白、1 mL注射器、三分试管、加样器、加样滴头、打孔器、琼脂扩散平板等。
1.2 试验方法
1.2.1 病死鸡剖检 将送检的病例进行尸体剖检,外部检查之后用清水将禽体羽毛浸湿,切开大腿与腹侧连接的皮肤,用力将两大腿向外翻压直到两髋关节脱臼,使禽体背卧位平躺。在泄殖孔前的皮肤作一条横切线,由此切线中部沿腹中线由后向前剪开皮肤,直到喙角,使腹部和胸部皮肤分离,进行临床剖检诊断。在临床症状观察、尸体剖检的基础上,从待检鸡的背部、翅尖、尾尖拔取含有羽髓丰富的羽毛供实验室检验,以寻求确诊。
1.2.2 病理组织切片
(1)切片制备。固定:用福尔马林固定24 h。浸洗:用自来水冲洗组织块24 h。脱水:洗涤后组织块在70%、80%、90%、95%、100%(A),100%(B)乙醇中每级各停留2 h。透明:把组织块放到二甲苯中至透明。浸蜡与包埋:将已透明的材料放入石蜡中,使材料中充满石蜡;将包埋用的石蜡倒入小瓷槽内,用镊子将浸过石蜡的材料放入倒有石蜡的小瓷槽内,当表面冷却后,将小瓷槽轻快地放入冷水中,使蜡块浮起后,即可收取,待切。切片:首先将包埋于同一蜡块中的材料分开,使每一小蜡块中只含有一块材料;然后,将蜡块修成四方形或长方形,并粘在木块上;这时将蜡块固定在切片机上进行切片,厚度在5 μm之间。展片与贴片:首先将蜡带斩为单片,再将单个蜡片放于40 ℃的温水中,使其展开,展平,再取一张中央涂有甘油-蛋白胶的载片伸入温水中,将蜡片捞于载片中央,倾去多余的水份后置于干燥箱中,60 ℃条件下烘干。染色、脱水、透明:把浸于70%乙醇的组织块加入倍量蒸馏水,两次稀释至蒸馏水约2 h,投入碘酸钠苏木精,蒸馏水分色10 h,自来水蓝化3 d,蒸馏水洗1 min,70%、80%、90%乙醇逐级脱水各1 h,伊红溶液染色2 d,90%乙醇(A)、(B)脱水与分色各1 h,100%乙醇(A)、(B)各脱水1 h,二甲苯(A)、(B)透明各1 h。封存:将已经透明的切片从二甲苯(B)中取出,滴加树胶,盖上盖玻片即可,拷干后制成永久性标本。
(2)注意事项。组织固定:用于组织固定的材料必须新鲜,采集和分割后要立刻固定,不得延误;固定材料体积的大小,以不超过直径5 mm为准,材料与固定液的比例,以1:20为准;所用固定液以新配的为好,并放置在阴凉处,不要在日光下直晒;材料固定完毕后,必须在容器外贴上标签,以防止相互混淆。组织脱水:组织脱水是在低浓度乙醇中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体;在高浓度乙醇中,每级停留时间也不宜太长,否则可使组织收缩变脆,影响切片;脱水应彻底干净,否则与二甲苯混合后,将呈乳白色浑浊,虽然可以倒回重脱,但效果不好;如需过夜,应停留在70%乙醇中。组织块透明:组织块透明时要注意二甲苯极易挥发,故在切片透明之后,从染色缸中取出封藏,手续要敏捷,不宜久置,否则待二甲苯挥发干净后,组织就会变硬发白,即使再加树胶封藏,由于树胶不能浸入组织,封后也无用处;二甲苯极易吸收空气中的水分,故在湿度大的天气,贮有二甲苯的染色缸的盖子周缘可涂少许凡士林,以防止水分的渗入。在封片时也不宜将口鼻过分靠近切片,以免水气侵入,出现白色云雾状;二甲苯必须保持无水无酸。若用1~2滴石蜡油滴入其中,立即出现云雾状,即表示其中已含有水分,不能再用。石蜡切片制作:检验过程中,石蜡切片制作出现了材料裂隙、破碎的情况,请做类似试验时借鉴。
通过流行病学、临床症状、剖检变化、组织学观察可以作出诊断,进一步确诊还需进行琼脂扩散沉淀实验、病毒分离等方法。
1.2.3 血清学诊断(琼脂扩散试验)
(1)用MD抗原检测被检鸡血清样本,用滴管在中央孔加入MD抗原,标准阳性血清分别加入外周1、4孔。被检鸡血清按顺序分别加入4个外周孔中,每一个被检样用1个滴头。加样完毕,盖上平皿,做好标记、编号,放入带盖湿盒中,置37 ℃温箱内24~48 h,观察并做详细记录。
(2)用MD阳性血清检测鸡的羽髓,选拔被检鸡含羽髓的翅羽或身体其他部位的大羽(或新生羽)数根,将含有羽髓的羽根按鸡的编号分别集于三分管内,每管加2~3滴蒸馏水,用玻璃棒将羽根压集于管底,以适当的压力转动玻璃棒,挤压出羽髓后倾斜试管,用毛细管顺次加到外周受检孔中(2、3、5、6孔)。中心孔加入MD阳性血清,外周1、4孔加入标准抗原。加样完毕,盖上平皿,做好标记、编号,放入带盖湿盒中,置37 ℃温箱内24~48 h,观察并做详细记录。
注意事项:应多拔几根新羽来检查;加样时,以把孔加满为度,切忌样品溢出,影响判定结果;与邻接孔连片时应作废处理;MD阳性血清避免反复冻融,以防降低效价而影响检出结果;在琼脂扩散试验时,还要注意羽囊同边缘孔紧密吻合,防止羽囊径小,边缘孔大,抗原扩散不充分,降低查检率。
判定标准:标准抗原与标准阳性血清两孔间形成清晰的白色沉淀线。被检材料孔与标准试剂孔间出现明显的沉淀线,或标准阳性试剂间的沉淀线末端向被检材料一侧曲,判为阳性。有的被检材料可能出现1条以上的沉淀线,仍判为阳性。无沉淀线则为阴性。
1.2.4 病毒学诊断(病毒分离) 分离病毒的材料,采用病鸡的抗凝血,由于MDV具有高度的细胞结合性,在分离材料的处理过程中,除保持无菌条件外,还必须保持分离细胞的生理活性。
(1)鸡胚接种法。试验组:将0.1 mL的病料分别接种于10只4~5日龄鸡胚卵黄囊内,分别于接种后4~6 d和10~11 d观察绒毛尿囊膜上是否产生典型的疱疹病毒痘斑。对照组:将0.1 mL的抗凝剂分别接种于10只4~5日龄鸡胚卵黄囊内,分别于接种后4~6 d和10~11 d观察,与试验组进行对照。
(2)雏鸡接种法。试验组:选择1日龄或1周龄的易感鸡10只,将病料如病鸡的抗凝血0.5 mL经腹腔接种,然后严格隔离饲养观察,接种后18~21 d,观察是否产生鸡马立克氏病的特征性病理变化。对照组:选用抗凝剂0.5 mL经腹腔接种,同时隔离饲养观察,与试验组进行对照。
2 结果与分析
2.1 病理剖检结果
在送检的30只病死鸡中,22只出现坐骨神经、迷走神经等单侧性神经肿大而变粗,呈黄白色水肿样变化;21只出现肝脏肿大、质脆,表面观察到大小不等的白色结节;17只出现心外膜可见绿豆至黄豆大小的白色结节,形状呈球形、椭园形或不规则形,结节突出于心脏表面致使心外膜凹凸不平;15只出现脾脏肿大,包膜紧张,切面膨隆外翻;18只出现肾脏肿大,前肾隆起凸入腹腔,可见大小不等的灰白色结节;22只腺胃黏膜乳头肿胀,乳头之间可见出血斑;23只肌胃角质膜下观察到线状出血斑;16只十二指肠黏膜充血或出血病变;20只盲肠扁桃体肿胀、出血;22只泄殖腔黏膜线状出血病变;20只法氏囊出现萎缩。4只无明显剖检病理变化。
2.2 病理组织切片结果
2.2.1.心脏 心肌纤维颗粒变性、水泡变性。在血管周围、肌纤维间、心外膜下有淋巴细胞呈浸润性增生。肌纤维脂肪变性,局部蜡样坏死。
2.2.2 脾脏 鞘动脉周围、淋巴小结出现大量淋巴细胞、网状细胞。淋巴细胞核碎裂、边集,并见核分裂相。
2.2.3 肝脏 肝细胞颗粒变性、水泡变性、部分坏死。窦周隙狭窄,散在少量的红细胞和淋巴细胞。中、小淋巴细胞、网状细胞在静脉周围浸润。在肝小叶内局灶性增生。增生灶内有呈空泡状的原始网状细胞和核边集的凋亡淋巴细胞。肝细胞坏死处有淋巴细胞集聚。
2.2.4 肾脏 肾小球体积增大。肾小囊腔狭窄。并有血红蛋白样物质。肾小囊壁上皮细胞肿胀。局部肾小球萎缩,出现代偿性增大。肾小管上皮细胞从颗粒变性、水泡变性到细胞坏死、胞膜破裂,整个肾小管呈均质红染。肾小管内有血红蛋白样物质,呈尿管型。
2.2.5 坐骨神经 神经纤维间水肿液内散在中小淋巴细胞及浆细胞。局部灶性增生。
2.2.6 卵巢 皮质和髓质见有结节性或弥漫性网状细胞、淋巴细胞集聚。淋巴细胞核显分裂相,局灶性增生细胞排列呈涡漩状。部分卵泡全部被多形态淋巴细胞所代替。
2.2.7 腺胃 腺小管腺细胞开始呈颗粒变性、水泡变性,逐渐坏死,腺小管内散在流失的胞浆。淋巴细胞和网状细胞在腺小管间、肌层间、浆膜下浸润和增生。
2.2.8 十二指肠 肌层肌细胞和肠绒毛上皮细胞变性、坏死。浆膜、浆膜下肌层、肠腺间和绒毛固有层出现不同程度的大中小淋巴细胞浸润和增生。肠腺间有网状细胞增生。
2.2.9 肺 血管内、外散在淋巴细胞。血管周围肺小叶间隔有少量的淋巴细胞浸润,局部肺泡间隔及支气管周围充满大量的大中小淋巴细胞、少量的网状细胞。肺小叶内充满淋巴细胞、红细胞,局部实质内全被肿瘤细胞代替。
2.3 血清学诊断的结果
30份病料中,26份阳性,4份阴性。21份产生清晰可见的灰白色沉淀为阳性,5份产生一条以上的沉淀线,但仍属于阳性,4份无沉淀线则为阴性。
2.4 病毒分离的结果
通过试验组与对照组的比较,试验组雏鸡接种后可见肝、脾表面和切面均可见白色结节状肿瘤,肾、卵巢褪色、肿大等典型鸡马立克氏病的特征性病理变化。
试验组鸡胚接种,在绒毛尿囊膜上可出现MDV引起典型疱疹病毒痘斑。在检查痘斑时应注意区别其他病原引起的类似痘斑。
通过产生的这种典型疱疹病毒痘斑可对鸡马立克氏病进行确诊。
3 防治措施
3.1 加强饲养管理和卫生管理
加强饲养管理,改善鸡群的生活条件,增强鸡体的抵抗力,对预防该病有很大的作用。饲养管理不善、环境条件差或某些传染病如球虫病等常是重要的诱发因素。定期搞好鸡舍尤其是出雏室和育雏舍的彻底消毒,防止雏鸡的早期感染是非常重要的,否则即使出壳后即刻免疫有效疫苗,也难防止发病。
3.2 疫苗接种
目前国内使用的疫苗有多种。按产地可分为进口疫苗和国内生产的疫苗。按血清型可分为三种,血清1型疫苗:主要是减弱弱毒力株CV1-988、814疫苗;血清2型疫苗:主要有SB-1、301B/1、Z4株;血清3型疫苗:即火鸡疱疹病毒HVT-FC126疫苗。按疫苗所有毒株种类,可分为单价苗、二价苗和三价苗等。自20世纪80年代开始,由于出现了超强毒,单价苗免疫失败屡屡发生,因此有些学者提出多价苗战略,并先后研制出多价苗,二价或三价苗等。
4 小结
本试验对30只病死鸡进行剖检诊断,病理组织切片观察,琼脂扩散试验和病毒分离试验进行诊断。病理剖检见坐骨神经、迷走神经单侧性肿大以及肝脏肿大、质脆等;光镜下,肝组织中集聚大量淋巴样细胞,心肌纤维间弥散大量多形性淋巴细胞;琼脂扩散试验结果为:26份阳性,4份阴性。将病料接种雏鸡,雏鸡均出现典型的鸡马立克氏病病理变化;病料鸡胚接种见绒毛尿囊膜上出现明显疱疹病毒痘斑;确诊30只疑似病例中,有26只患有鸡马立克氏病,4只无明显马立克氏病的明显症状。目前对该病尚无特效疗法,其防治关键是疫苗接种并同时做好综合防治。
参考文献:
[1] 金春富,赵福奎,吴常义.鸡马立克氏病的诊断及综合防制[J].畜牧兽医科技息,2010,(1):79.
[2] 霍击斯塔.禽病学(上册)[M].第2版,胡祥壁译.北京:中国农业大学出版社,1983.
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