四川省十五个桑树主栽品种SRAP分子标记分析

张楠 丁祥 钱叶 危玲 黄盖群

摘 要 利用SRAP分子标记研究了四川省15个主栽桑树品种的遗传多样性，探讨其的基因结构特点，明晰其种质的亲缘关系。对扩增后的条带进行测序，利用DNAMAN分析软件分析15个品种的遗传关系，15份品种可被分为4大类。结果表明，SRAP标记技术在评价四川省15个主栽桑树品种的亲缘关系和遗传多样性等方面具有很好的适用性，可为桑树种质资源DNA指纹图谱的建立及品种间鉴定提供科学依据。

关键词 桑树；SRAP分子标记；遗传多样性；四川省

中图分类号：S888 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2016）15--02

我国是桑树遗传多样性的起源中心之一[1]，栽桑历史悠久。我国桑树育种工作者从20世纪30年代开始进行桑品种的选种工作，截止目前，我国共保存桑树种质资源近3 000余份，分属15个桑种及4个变种，其中栽培种5个，野生种10个，是世界上桑种最多的国家。

开展对桑树不同品种的亲缘关系及遗传多样性研究，对桑树种质量资源收集、核心种质保存及新品种选育均具有重要意义。本研究通过从桑树幼嫩叶片中提取基因组DNA，采用SRAP技术对15个桑品种的遗传背景和遗传关系进行分析鉴定，从DNA水平上对桑树种质资源的遗传多样性进行鉴定及核心种质的确定，为桑树品种重要农艺性状基因的发掘与利用提供理论依据和应用基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料为保存于四川省农业科学院蚕业研究所桑树种质资源圃的地方种质资源15份。2015年7月上旬采取15个四川省主要栽培品种健壮、无病虫害植株的幼嫩叶片10 g左右装入50 mL离心管中，及时编号装入冷藏采样箱暂存，保存于-80 ℃超低温冷冻冰箱，取样应在上午气温未升高，即09：00前完成。

1.2 DNA提取

DNA提取采用从北京天根生物技术有限公司所购买的植物基因组DNA提取试剂盒进行桑叶DNA的提取。

1.3 SRAP引物

SRAP序列来自加拿大哥伦比亚大学（UBC），引物合成于深圳华大基因科技服务有限公司。

1.4 PCR扩增

SRAP-PCR反应体系25 ul，包括40 ng模板DNA、1 ul引物（10 ng/ul）、1UTaq DNA聚合酶、2.5 ul10×PCR buffer和0.5 uldNTPs（10 mmol/L），ddH2O补足至25 ul。

SRAP-PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，35℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共5个循环；94℃变性1 min，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[2，3]。所用PCR仪为美国所产BIO-RAD T100 Thermal Cycler。扩增产物通过2%琼脂糖凝胶（通过提高琼脂糖浓度使得条带分散显得更清晰）（含0.5 ug/L Gold ViewⅡ型核酸染料）电泳进行检测，并使用凝胶成像系统对电泳结果进行拍照记录。

1.5 数据分析

50对SRAP引物对桑树总DNA进行PCR扩增，其中5对引物能够扩增出得到稳定，清晰并且容易计数的条带，在这5对引物中挑选一对PCR扩增产物进行条带回收测序，本次实验选用的是第11号SRAP引物进行测序分析。测序所得结果采用DNAMAN软件进行比较分析，鉴定这15个品种间的遗传关系，并对其进行分类。

2 结果与分析

以15个桑品种SRAP-PCR扩增反应产生的条多态性条带为基础数据，对11号引物扩增所得条带进行回收并且测序。利用DNAMAN软件对测序后的结果进行比对分析，结果显示，SRAP可将这15个桑品种分为四大类，其中川7637单独为一类，即第一大类；台湾果桑和川826为一大类，即第二大类；农桑14号，湘7920，川桑48-3，川桑83-5，新之一濑，实钴11-6，蜀葚1号，川7431，川桑98-1，油桑，川桑83-6为一大类，即第三大类；湖桑32号单位为一大类，即第四大类。

3 结论与讨论

SRAP标记技术是一种基于PCR水平上发展起来的新型分子标记技术，由美国加州大学蔬菜系Li与Quiros博士于2001年在芸薹属作物开发出来[4]。而一个物种的多样性主要包括遗传多样性，但是其会受到诸多因素的影响，如地理分布、气候变化、物种的遗传变异和进化地位等。本研究利用50条SRAP引物种筛选得到5条多态性高、稳定性强的引物，对15个桑种总DNA进行扩增反应，选取其中一条引物扩增所得条带进行测序分析（本实验所选引物为第11号引物），测序所得结果采用DNAMAN软件进行数据分析，在测序水平上SRAP11可将这15个引物分为四个大类，每大类中同一生态环境、靠近或同在一个地理位置的资源，亲缘关系越近，遗传距离也就更近。结果显示，本研究所选桑种种质资源遗传基础较丰富，而经过筛选所得的引物在评价桑树品种的亲缘关系和遗传多样性等方面有很好的适用性。

参考文献

[1]陈仁芳，张泽，唐洲，等.桑属ITS、trnL-F、rps16序列与进化分析[J].中国农业科学，2011（44）：1553-1561.

[2]林强，邱长玉，赵卫国，等.32份广东桑类型桑树种质资源亲缘关系的SRAP标记分析[J].蚕业科学，2011（37）：373-379.

[3]王华忠，吴则东，王晓武，等.利用SRAP与SSR标记分析不同类型甜菜的遗传多样性[J].作物学报，2008（34）：37-46.

[4]林强，朱方容，邱长玉，等.广西桑树种质资源亲缘关系的SRAP分析[J].南方农业学报，2011（42）：358-363.

（责任编辑：赵中正）