基于发根农杆菌的大豆CRISPR/Cas9系统靶点可行性的快速检测方法

罗可 王珞 刘辉

摘要 研究选取大豆FAD2-1A和FAD2-1B基因为靶标，使用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建靶点的基因敲除载体，并利用发根农杆菌K599的特性侵染大豆植株，以获取不定根，通过对不定根的DNA提取和PCR测序鉴定，发现靶点前的序列峰图平稳且准确，在靶点处开始出现杂乱的套峰，表明大豆FAD2-1A与FAD2-1B2个基因均被成功编辑。此方法操作简单、实验周期较短，实现了对大豆中选择靶点的可行性的快速鉴定，为研究大豆的FAD2基因功能和遗传改良方面提供了新的技术支持。

关键词 CRISPR/Cas9；大豆；发根农杆菌；基因编辑

中图分类号：S565.1 文献标识码：B 文章编号：2095–3305（2023）07–0056-03

大豆是世界上主要的油料作物之一，能够为人类和动物提供丰富的蛋白质和油脂[1]。随着大豆基因组测序工作的完成，以及基因组学、生物技术的快速发展，从基因层面通过分子育种从而培育新的大豆品种成为重要的研究方向。

基因组编辑技术又被称为靶标基因工程，它通过编辑特定的基因、敲除基因、引起特异位点突变等方式修饰基因，是研究植物基因功能的重要方法之一[2]。种子中的油脂和蛋白质含量是油料作物大豆品質的重要评价标准[3]，利用基因编辑技术对大豆相关基因进行靶向修饰，通过研究大豆中油脂和蛋白质合成途径相关功能基因，可进一步培育得到高油酸、高品质的大豆。近年来，尽管基因组编辑技术在大豆中得到了迅速应用，然而相对于水稻、拟南芥等植物的研究，大豆基因编辑技术的应用仍处于发展缓慢阶段。

CRISPR/Cas9技术在大豆的应用有以下问题面临解决：首先，适合大豆基因编辑技术的系统研究发展缓慢，大豆整体基因编辑效率维持在10%左右，与基因编辑效率达到80%的水稻等植物相比，存在着巨大差距[4]。不仅如此，大豆遗传转化效率低会影响阳性编辑体的植物的获得；目前大多都采用农杆菌介导的大豆遗传转化体系，虽该体系经过改良和优化，但遗传转化率仍不理想，也大大降低了基因编辑技术在大豆改良上的进一步应用。因此，在遗传转化前验证基因功能编辑靶点的可行性显得尤为重要。

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）是一种革兰氏阴性的土壤杆菌，属于根瘤菌科[5]，在其侵染植株后，能够诱导植株产生大量高度分支的不定根。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了用于敲除大豆基因的载体，并通过发根农杆菌介导的方法使大豆产生不定根，以验证FAD2基因上编辑靶点的可行性，为大豆基因组编辑和基因功能的验证奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

植物材料大豆品种为黑河43，基因编辑载体PBSE401与中间载体购自BIOSCI生物公司；大肠杆菌E.coli DH5α购自Biomed 生物公司，发根农杆菌K599购自上海唯地生物技术有限公司。DNA纯化回收试剂盒和质粒提取试剂盒（TIANGEN生物公司）；Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；限制性内切酶BsaⅠ、T4 DNA Ligase购于New England Biolabs（NEB）有限公司；DNA提取试剂盒、引物合成及测序来自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 靶点选择 通过CRISPR靶点序列在线设计工具CRISPOR设计FAD2-1A、FAD2-1B基因的敲除靶点，该工具能够在输入序列中找出所有的CRISPR/Cas9靶位点，基于GC含量与二级结构最终选取靶点T3与T28设计sgRNA，sgRNA扩增引物及鉴定引物详见表1。

1.2.2 载体构建 根据Geneious软件设计的sgRNA序列，以PCBC载体为模板，扩增目的片段，PCR反应体系50 μL：5×Phanta Buffer 10 μL、dNTP 1 μL、FAD2-DT1-BsF 2 μL、FAD2-DT1-F0 0.5 μL、FAD2-DT2-BsR 0.5 μL、FAD2-DT2-R0 2 μL、Phanta 1μL、ddH2O 32 μL、共计50 μL。反应程序：95 ℃ 3 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 40 s、从第2步起循环35次、72 ℃ 5 min。将带有T3、T28的 sgRNA的靶点片段最后进行 Golden Gate 反应，体系5 μL：PBSE401 2 μL、PCR回收片段1 μL、10×BSA 0.5 μL、T4 DNA Ligase Buffer 0.5 μL、T4 DNA Ligase 0.5 μL、BsaⅠ0.5 μL，共计5 μL。最后采用T7酶切检测法，对靶点编辑情况进行初步验证。

1.2.3 发根农杆菌K599介导大豆遗传转化 本实验采用黑河43大豆材料，参考已有的大豆不定根诱导方法，利用发根农杆菌K599，通过注射诱导大豆不定根，发根后，使用试剂盒提取不定根样品DNA，用引物对靶点附近的序列进行PCR扩增，将扩增的目的片段进行回收测序，以验证分析靶点处是否出现基因编辑。

2 结果与分析

2.1 敲除载体的构建

大豆的脂肪酸去饱和酶2（FAD2）决定了大豆油中单不饱和脂肪酸的水平，能够催化单不饱和脂肪酸—油酸转化为多不饱和脂肪酸—亚油酸。大豆FAD2基因家族由多个基因组成，其中FAD2-1A和FAD2-1B主要在发育的种子中表达，可能影响大豆油中的油酸水平。研究表明，FAD2-1A和FAD2-1B的敲除能够显著提升油酸含量，降低亚油酸含量[6]。FAD2-1A和FAD2-1B均只含2个外显子，编码388个氨基酸，其CDS序列同源性高达94.9%（图1A）。

通過查找cDNA序列上的PAM位点发现：能够共同靶向FAD2-1A和FAD2-1B的靶点有4个，基于GC含量与二级结构筛选出2个合适的目标靶点，均位于2号外显子上，其中靶点T1的5＇端第一个碱基有所不同，而靶点T2则完全一致（图1B）。

实验所用CRISPR/Cas9敲除体系为PBSE401双元体系，通过将含2个靶点的sgRNA表达元件连接至二元载体PBSE401，形成最终的敲除载体（图1C）。

2.2 种苗生根观察选取

将注射菌悬液后培育2周的大豆种苗从蛭石中取出，即可清晰地观察到其在发根农杆菌的作用下生长许多不定根，将长势良好的根系剪下，利用DNA提取试剂盒提取大豆不定根（图2）。

2.3 不定根编辑效率检测

T7核酸内切酶BsaⅠ能够识别并切割不完全配对DNA、Holiday结构或交叉DNA、异源双链DNA、十字形结构DNA，或者以更慢的速度切割双链DNA。本实验利用T7核酸内切酶BsaⅠ识别并切割不完全配对DNA的特性，将包含野生型和突变型2种类型的PCR突变杂合体产物进行T7检测切割，在退火复性后形成不完全匹配的序列，进而用T7核酸内切酶进行切割，编辑个体在实验结果中呈现出与野生型不同的切割条带（图3）。

T7酶切结果表明：在7个不定根样品中，FAD2-1A基因在1、2、3、4、6号中呈现编辑阳性，FAD2-1B基因在7个样品中均呈现出编辑阳性，靶点编辑效率较高。基于上述结果，选取2号样品PCR产物进行Sanger测序，发现靶点前的序列峰图平稳且准确，在靶点处开始出现杂乱的套峰，编辑类型主要为碱基替换，在FAD2-1A的T3靶点处存在小片段的缺失，表明2号样品的FAD2-1A和FAD2-1B基因均被编辑（图4）。测序结果与酶切结果一致，说明通过诱导大豆不定根介导的CRISPR/Cas9基因敲除技术能够体外检测大豆敲除靶点的可行性与编辑效率。

3 讨论

随着生物技术和基因组学的发展，以及基因编辑技术的逐步深入与完善，其效率高、操作简单、成本低等优势逐步显现，逐渐成为农作物功能基因组研究和农艺性状改良的有效工具。Li等[7]利用CRISPR/Cas9技术靶向了大豆贮藏蛋白基因，培育出高蛋白大豆，为大豆育种工作提供了宝贵的新资源。2018年，Curtin等[8]利用基因编辑技术编辑了大豆参与小RNA加工的基因，获得能对盐胁迫和干旱进行相应的突变体植株。近几年CRISPR/Cas9技术虽然在大豆上取得了不错的进展，但依然面临着不少的“瓶颈”。大豆遗传转化体系周期长、效率低问题；同时大豆基因编辑还存在打靶效率低下、可用编辑基因较少等困境。因此，如何提高替换效率、降低脱靶效率，提升遗传稳定性成为大豆在基因编辑领域的研究重点。

综上，在大豆进行基因编辑和遗传转化前，对于基因编辑靶点的可行性检测显得十分重要。利用发根农杆菌介导的大豆植物子叶外植体产生不定根，并提取不定根DNA以检测基因编辑靶点效率的方法，具有操作简单、试验周期短的优点。利用此方法可快速测定基因编辑靶点的可行性，避免在实验过程中出现脱靶现象。

在本试验中，使用CRISPR/Cas9系统构建了靶点敲除载体，以敲除大豆基因FAD2-1A和FAD2-1B基因，并利用发根农杆菌K599介导大豆植株产生不定根。通过对不定根DNA的提取和PCR扩增测序，结果表明：编辑载体构建成功，并成功对基因FAD2-1A和FAD2-1B进行了编辑，证明该靶点可靠、有效，可用于对大豆植株基因编辑和遗传转化。

参考文献

[1] 李颖，鞠斯羽，魏健.农杆菌介导的大豆遗传转化体系研究进展[J].农业与技术，2022，42（17）：27-30.

[2] 唐雨薇.CRISPR/Cas9介导的茶树基因组编辑技术体系的构建[D].长沙：湖南农业大学，2018

[3] 陈笑，冯献忠.基因组编辑技术在大豆遗传改良中的应用[J].农业生物技术学报，2021，29（4）：789-798.

[4] 黄娇娇，曹春伟，郑国民，等.基因组编辑技术在猪遗传改良中的应用[J].遗传，2017，39（11）：1078-1089.

[5] Attila K， Dong X L， Arief I， et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology[J]. Nature Protocols， 2007， 2（4）： 948-952.

[6] Haun W ， Coffman A ， Clasen B M ， et al. Improved soybean oil quality by targeted mutagenesis of the fatty acid desaturase 2 gene family[J]. Plant Biotechnology Journal， 2014， 12（7）： 934-940.

[7] Li C L， Nguyen V， Liu J， et al. Mutagenesis of seed storage protein genes in soybean using CRISPR/Cas9[J]. BMC Research Notes， 2019， 12（1）：176.

[8] Curtin S J， Xiong Y， Michno J M， et al. CRISPR/Cas9 and TALENs generate heritable mutations for genes in‐volved in small RNA processing of Glycine max and Medicago truncatula[J]. Plant Biotechnology Journal， 2018，16（6）： 1125-1137.

A Rapid Detection Method for the Feasibility of Soybean CRISPR/Cas9 System Targets Based on Agrobacterium rhizogenes

Luo Ke et al（Biotechnology Research Institute， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Guizhou Province， Guiyang， Guizhou 550009）

Abstract The CRISPR/Cas9 gene editing method was used in this study to create gene knockout vectors for the soybean FAD2-1A and FAD2-1B genes. Agrobacterium rhizogenes K599 was then used to infect soybean plants and produce adventitious roots. The adventitious roots DNA was extracted， and PCR sequencing revealed that the adventitious roots sequence peaks were smooth and accurate before the target， and chaotic overlaid peaks started to develop near the target， showing that the soybeans FAD2-1A and FAD2-1B genes had been successfully altered. This approach offered novel technical assistance for the investigation of the FAD2 gene function and genetic advancement in soybeans. It was straight forward to use， has a brief experimental cycle， and enables rapid identification of the viability of target selection in soybeans.

Key words CRISPR/Cas9; Soybean; Agrobacterium rhizogenes; Gene editing