硫磺负离子添加剂对SD大鼠的发育毒性研究

冯金曼， 崔明勋， 姜成哲*， 金 美， 李 镐

(1. 延边大学农学院；2. 延边大学药学院:吉林 延吉 133002)

现在的新型饲料添加剂已经能够满足生产中的很多特殊需求，应用范围也被扩大到各类动物的养殖业中[1]。矿物质饲料添加剂合理地配制及使用，能够在很大程度上保证动物的健康并提高动物的生产力，但若采食的矿物质数量超过了自身需要量或承受限度时，就会发生中毒或引起不良影响。矿物质饲料添加剂产品质量的安全性问题，主要是限制有毒害元素的最大允许量，并以标准形式做出明确规定[2]。矿物质饲料添加剂是当今社会使用最多的饲料添加剂之一，约占饲料添加剂总用量的66%～72%。

该试验研究的硫磺负离子添加剂是将存在于大自然的多种矿物质用现代高科技纳米技术对矿物质进行粉碎、筛选、分离、烘干等程序加工，并按合理的科学配比混合而成。本产品可广泛使用于鸡鸭、猪狗、牛羊等家畜饲养及鱼、虾等水产类养殖，也可使用于蔬菜、瓜果类的种植和栽培。本产品具有解毒、祛毒功效，所以对提高动植物健康质量起到很好的作用[3-5]。

致畸敏感期毒性在评判受试物的毒性时发挥重要的作用。该试验的目的是观察硫磺负离子矿物质添加剂经口服后对SD受孕雌鼠产生的敏感期致畸毒性。通过观察母鼠及胎儿的多项指标来判断硫磺负离子添加剂对实验动物的生殖及胎儿发育是否有毒性或致畸作用。为其进一步开发利用提供一定基础。

1 材料与方法

1.1 药品

硫磺负离子添加剂由吉林省延吉市永大饲料有限公司提供。甲醛、乙醇、氢氧化钾、甘油、茜素红、苦味酸、乙酸、羧甲基纤维素(CMC)都是国产分析纯。乙醇固定液(95%乙醇)、饱和苦味酸溶液、鲍因氏(Bouins)固定液、茜素红应用液、1% CMC溶液。

硫磺负离子添加剂混悬液：

低剂量(T1组)：100 mg/100 mL。

中剂量(T2组)：333 mg/100 mL。

高剂量(T3组)：1 000 mg/100 mL。

1.2 方法

1.2.1 试验动物及饲养环境

试验动物：SD大鼠，雌性体重为220～280 g，雄性体重为350～400 g，雌性鼠均是未进行过交配的大鼠，由延边大学实验动物中心提供。动物饲养于延边大学药学院动物实验室的屏障环境设施内。室温20～26 ℃，湿度40%～70%。SD大鼠均在标准饲养盒内喂养，每笼大约3～5只，自由饮水和进食。饲料是由延边大学饲料中心提供的全价饲料，实验室内自来水经过初步过滤处理后供大鼠饮用。

1.2.2 实验动物分组

将实验的SD大鼠，按照雌雄2∶1的比例同笼混合交配，第2天凌晨给雌鼠作阴道涂片，在显微镜下观察涂片看是否有精子或阴道栓出现，将能观察到的雌鼠作为受孕0 d，然后将受孕雌鼠随机分为4组，每组15只，所分4组分别为硫磺负离子高、中、低剂量组，及1% CMC溶液对照组(5 mL/kg)。所有孕鼠都于受孕第6～15天(致畸敏感期)灌胃给药，按照体重的不同给药量均为10 mL/kg。

1.2.3 一般体征检查

每天及时观察孕鼠毛色、五官、行为等一般体征状况，记录是否有异常情况出现。各组受孕雌鼠在受孕的3、6、9、12、15、18 d称量添加的饲料量，次日同一时间称量剩余的饲料量，减少的饲料量即为当日大鼠的进食量。

雌鼠于受孕后第20天将全部处死，观察有无异常或病变脏器。剖开子宫取出胎鼠(先做外观检查)、胎盘，记录黄体数，观察统计死胎数(早期死胎、晚期死胎)、着床数、吸收胎数，活胎数，称量活胎重、胎盘重，用游标卡尺测量胎鼠体长、尾长、肛长(肛门到尿道的距离)，统计胎鼠性别数，外观是否异常等。测量完上述事项后将约1/2胎鼠固定于Bouins氏液，作内脏检查，其余的固定于95%乙醇溶液中作骨骼畸形检查。

胎鼠的外观检查：先检查胎鼠的头部，观察有无露脑，脑膜膨出等情况；观察胎鼠头部大小，是否有特别小或特别大的畸形情况；胎鼠五官中眼，耳，口，鼻的外观有无异常情况；上下颌有无唇裂；然后进行四肢、躯干及尾部的检查；观察胎鼠有无腹部裂开，脐疝，脊柱断裂，脊髓膨出，脊柱侧突等情况；观察胎鼠的尾巴有无短尾，卷尾，无尾等情况。

1.2.4 胎鼠的内脏检查

大约2周后取出固定在Bouins液中的胎鼠，用流水冲去固定液，用单面刀片对胎鼠进行切片检查。检查时先将胎鼠放在蜡板或者木板上，切去胎鼠的四肢和尾部，用左手固定住胎鼠，然后右手持刀片从头部开始往下做横切或者纵切[6]。根据不同部位的断面情况观察胎鼠器官发育的大小、性状和相对位置是否正常。

沿胎鼠腹中线切开胸腔、腹腔，检查胎鼠的肺、心、横膈膜、肝、胃、脾、肠等器官的大小、位置及是否畸形。检查完毕后均将其摘除，然后检查胎鼠的肾、输尿管、膀胱、子宫或睾丸的大小、位置及发育情况。最后将肾脏切开，检查是否有肾盂积水和扩大[7]。

活胎率/%=活胎仔数/胎仔总数×100%

死胎率/%=死胎在数/胎仔总数×100%

畸胎率/%=有畸胎动物数/妊娠动物数×100%

吸收胎率/%=(早期吸收数+中期吸收数+晚期吸收数)/胎仔总数×100%

早期吸收胎率/%=早期吸收数/胎仔总数×100%

晚期吸收胎率/%=晚期吸收数/胎仔总数×100%

外观畸形率/%=外观畸形数/检查胎仔数×100%

骨骼畸形率/%=骨骼畸形数/检查骨骼标本数×100%

骨骼异常率/%=骨骼异常数/检查骨骼标本数×100%

1.2.5 胎鼠的骨骼检查

2～3周后取出放在95%乙醇中固定的胎鼠，对胎鼠进行去皮、摘除内脏和脂肪(特别是背部脂肪)的操作。

染色完成后将胎鼠标本放入小平皿中，加入少量丙三醇溶液，用透视显微镜对胎鼠进行整体观察，然后对胎鼠的骨骼发育情况进行检查。先检查胎鼠头部的头顶骨、侧头骨及后头骨有无缺损及骨化情况，然后检查胸骨的骨化数目，有无缺失或融合情况。接着检查胎鼠的肋骨，观察是否有畸形情况出现，如融合肋、波状肋、短肋、分叉肋、肋骨中断、缺肋、多肋等。检查胎鼠颈椎、脊柱和椎体骨化数目(一般情况是颈椎骨化数7个，胸椎骨化数12～13个，腰椎骨化数5～6个，骶椎和尾椎骨化数7～9个)、有无融合及纵裂等情况。最后检查四肢骨发育情况及前后掌趾骨的骨化数目[8-9]。

1.2.6 数据统计

本试验的数据应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，对数据进行求平均值、标准偏差和t检验。本试验所有比率的数据分析比较均用X2检验。

2 结果与分析

2.1 各组孕鼠一般体征的观察

各组孕鼠的皮毛颜色及光泽、五官等外观，生理体征及日常行为等均未见异常。孕鼠的排泄物、分泌物等也均正常，无流产或死亡。

2.2 硫磺负离子添加剂对孕鼠进食量的影响

各组受孕雌鼠在受孕的第3、6、9、12、15和18 d称量添加的饲料量，次日同一时间称量剩余的饲料量，减少的饲料量即为当日大鼠的进食量。对同一天的各组进食量求平均值和标准差，并对试验组与对照组作t检验(表1)。T1组在12 d和T3组在9、12 d的进食量都较对照组显著增加(P<0.05)，其他组其他时间试验组与对照组比较均无显著差异，但是试验组的进食量都较对照组多。

表1 妊娠期间雌鼠进食量变化结果(mean ± SD)

注：*表示T组与C组比较，P<0.05，则有显著差异。

2.3 硫磺负离子添加剂对孕鼠体重的影响

硫磺负离子添加剂对母体体重增长的情况经常被认为是母体毒性的评判标准之一。在胚胎发育的致畸敏感期毒性试验中，从受孕第0天开始，在第3、6、9、12、15、18、20天称量雌鼠的体重，第20天为解剖日。统计各组孕鼠的体重变化情况如表2，同一天的各组大鼠体重情况之间做t检验(P>0.05)，20 d母鼠体重的增加量各组之间也做了t检验(P>0.05)，均无显著差异。

表2 妊娠期间雌鼠体重变化结果(mean ± SD)

2.4 硫磺负离子添加剂对胚胎的影响

受孕后第20天将全部孕鼠处死，剖开子宫取出胎鼠(先做外观检查)、胎盘，记录黄体数，观察统计死胎数(早期死胎、晚期死胎)、着床数、吸收胎数，活胎数，称量活胎重、胎盘重，用游标卡尺测量胎鼠体长、尾长、肛长(肛门到尿道的距离)，统计胎鼠性别数，外观是否异常等。各组实验数据统计结果如表3。结果表明，各实验组的测定结果与对照组以及各实验组之间无显著差异，说明添加剂对胚胎无不良影响。

表3 硫磺负离子添加剂对胚胎的影响 (mean ± SD)

2.5 硫磺负离子添加剂对胎鼠发育情况的影响

本试验对胎鼠的外观进行检查，所有胎鼠均未出现明显的肉眼可见的畸形现象。胎鼠的胎盘重量T1组与C组比较有极显著的增加(P<0.01)；T3组与C组比较有显著的增加(P<0.05)；T2组重量稍微有减少，但是与C组比较无显著差异(P>0.05)。T1组胎鼠的重量较C组有极显著的增加(P<0.01)；T2组胎鼠的重量较C组有显著增加(P<0.05)；T3组胎鼠的重量与C组无显著差异；T1组雌性胎鼠的肛长较C组显著变长(P<0.05)；T1组雌性胎鼠的体长较C组极显著变长(P<0.01)；T2组雄性胎鼠的尾长较C组显著变短(P<0.05)，雌性胎鼠的尾长显著变长(P<0.05)；其他各组数据与对照组均无显著差异(表4)。

表4 硫磺负离子添加剂对胎儿体重等的影响 (mean ± SD)

注：*表示T组与C组比较，P<0.05，有显著差异；**表示T组与C组比较，P<0.01，有极显著差异。

2.6 硫磺负离子添加剂对胎鼠外观特征的影响

对硫磺负离子添加剂的3个剂量组与对照组的胎鼠进行外观检查，胎鼠的头部、五官、躯干、四肢、尾部及肛门等均未见畸形，表明该产品对胎鼠的外观发育无明显影响。在高剂量组出现1例胎鼠个体非常小，但是外观无异常。

2.7 硫磺负离子添加剂对胎鼠内脏发育情况的影响

胎鼠整体经Bouins液固定后取出进行切片观察，硫磺负离子添加剂各试验组与对照组胎鼠内脏及脑内结构情况统计如表5。经Bouins液固定后的胎鼠情况如图1，胎鼠皮肤呈黄色，表面皱缩，但是组织和内脏等细微结构基本未发生变化。

对胎鼠的内脏及脑部情况进行切片观察，仅将出现异常的数据统计如表5，4个试验组中均无畸形胎儿出现。虽然有个别胎鼠出现头部异常、胸腺异常、肾盂和膀胱扩张等现象，但是数量很少，3个剂量组与对照组比较均无显著差异。

表5 硫磺负离子添加剂对胎儿内脏的影响 (mean ± SD)

图1 Bouins液中固定的胎鼠

2.8 硫磺负离子添加剂对胎鼠骨骼发育情况的影响

胎鼠的骨骼发育存在变异，包括胸骨和肋骨骨化不全；掌骨和头骨、骶骨和尾骨骨化程度不一样。肋骨有融合或断裂，头骨的头顶骨、侧头骨和后头骨骨化不全。胎鼠骨骼检查主要表现为胸骨、骶骨和尾骨骨化数目不同。胸骨主要表现为第5、6胸骨的缺失；前掌骨主要是第1、5趾骨骨化不全，后掌骨主要是第1趾骨骨化不全；肋骨主要异常是断肋；枕骨的0级骨化率在99%以上。胎鼠染色成功后的情况如图2所示，只有骨骼呈红色，其他组织均是透明。在透射光源下观察胎鼠的情况如图3所示，能清晰的观察到胎鼠的骨化情况。

对胎鼠的骨骼发育情况统计数据如表6所示，胎鼠的头骨、胸骨、掌骨及肋骨的骨化数试验组与对照组比较均无显著差异。各组胎鼠中均出现骨化不全的胎鼠，但是数量较少，各组之间没有统计学差异。

图2 胎鼠骨骼染色后情况

图3 透射光源下的胎鼠标本

项目组别C组T1组T2组T3组检查数55546260头骨骨化数5．87±0．825．85±0．836．00±0．005．87±0．60胸骨骨化数3．98±1．254．20±1．004．39±1．063．53±1．28前掌骨化数5．91±1．255．87±0．876．06±0．965．70±1．60后掌骨化数7．00±2．267．63±1．616．94±2．016．67±2．75肋骨骨化数12．9±0．1312．7±1．7712．9±0．1312．9±0．28骶骨和尾骨骨化数12．7±2．0111．57±2．0412．34±0．9610．28±2．05头骨骨化不全1103肋骨骨化不全1115

2.9 各组数据与SD大鼠致畸敏感期指标背景基数的比较

本试验有关内脏检测数据的计算按照1.2.4中的方法公式获得，与SD大鼠致畸敏感期指标背景基数的比较，都没有显著的差异，具体如表7所示。

表7 各组数据与SD大鼠致畸敏感期指标背景基数的比较(mean ± SD)

3 讨论与结论

发育中的胚胎或胎儿对致畸物的感受是一个复杂的过程。矿物质饲料添加剂的影响要从母鼠和胎儿2个方面分别去分析。

妊娠期间母鼠的进食量可见硫磺负离子添加剂能提高大鼠的食欲，增加其进食量。虽然母鼠妊娠期间体重增加没有显著差异，但是试验组增加量还是高于对照组，分析原因可能是试验组母鼠进食量增加导致体重增加。在试验过程中观察母鼠的外观及解剖后观察母鼠的主要脏器，均未发现明显的毒性现象。可见，硫磺负离子添加剂在本试验剂量时对母鼠无毒性作用。

本试验中胎仔发育的各项指标等数据统计表明，硫磺负离子对胎儿的发育不仅没有抑制作用，在一定程度上还存在促进作用，不存在明显的毒性作用。通过这些数据可知，各组胎鼠的生长发育情况基本正常，无明显的抑制现象。总之，在该试验过程中胎鼠未出现致畸现象。

在观察硫磺负离子添加剂对胎儿内脏的影响时，虽然各组均有少量胎儿异常，但是各组个体之间无统计学意义，即对胎儿内脏发育没有毒性作用。各试验组与对照组比较均无显著差异。头骨骨化数均在6左右，发育正常。胸骨骨化数在4左右，一般是第5,6胸骨骨化不全，各组之间无显著差异。左右前掌骨化数之和在6左右，主要是第1、5趾骨骨化不全；左右后掌骨骨化数在7左右，主要是第1趾骨骨化不全，各组与对照组比较均无显著差异。肋骨骨化数基本在13左右，有个别第13肋骨骨化不全。骶骨和尾骨骨化数高剂量组与其他各组之间差异较大，但是无显著差异，分析原因可能是高剂量组有1只母鼠所产的胎仔骨化情况都不好，其中有1只胎仔个体很小，全身无骨化情况，属于发育迟缓，但是整体与对照组比较无显著差异。可能是胎儿在发育过程中营养不良导致的，仅1例胎鼠个体异常小的现象不能说明硫磺负离子添加剂对胎儿的发育存在毒性[10]。

孕鼠怀孕的第6天开始受精卵着床，在第6～15天的这段时期长期以来被称为致畸敏感期[11]。一般致畸敏感期实验是选择在动物的致畸敏感期进行染毒，该试验不但能检测受试物的致畸性，还可以观察受试物致胚胎、胎仔死亡和生长迟缓等情况，是目前检测外源受试物致畸毒性最经典也是最可靠的方法。最近以来，利用实验动物在民族医药及疾病模型等研究方面不断有新的进展[12-16]。本研究采用SD大鼠做常规致畸敏感期毒性试验，检测硫磺负离子添加剂对孕鼠和胚胎发育的毒性，结果显示在100 mg/kg及以下剂量组，孕鼠均未见母体毒性，胚胎、胎仔各项生长发育指标及外观、内脏检查、骨骼检查也均未见异常；各剂量组与对照组比较虽然有数例胎鼠出现胸骨缺失，肋骨发育不全等现象，但组间比较差异无统计学意义，表明胸骨缺失属于正常现象，并非处理因素的结果。高剂量组较阴性对照组胎仔的发育情况稍微有差异，但是无统计学意义。分析原因可能是本品为矿物质不溶于水，只能配成混悬液对孕鼠进行灌胃，可能对母鼠的刺激较强，对母鼠会产生一定的影响，但是不能判断为毒性现象。

总之，硫磺负离子添加剂在本试验剂量时对孕鼠及胎仔的发育及健康无明显的毒性作用。

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