桦褐孔菌纤维素酶基因真核表达载体构建

张宇婷， 曲柏宏， 宁云山， 安丹丹， 李 健， 陈艳秋

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

桦褐孔菌纤维素酶基因真核表达载体构建

张宇婷， 曲柏宏， 宁云山， 安丹丹， 李 健， 陈艳秋*

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

根据已知的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶基因ORF全长序列，分别设计1对带有粘性末端酶切位点EcoRI和NotI的特异性引物，PCR克隆得到桦褐孔菌内切葡聚糖酶(endo-l,4-β-D-glucanase,EG)和β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BGL)ORF基因全长，将酶切后的目的片段分别与真核表达载体pPICZαA连接，构建出真核表达载体pPICZαA-EG和pPICZαA-BGL，并成功转化到毕赤酵母GS115中，为下一步纤维素酶的表达和功能验证奠定了基础。

桦褐孔菌；内切葡聚糖酶；β-葡萄糖苷酶；真核；载体构建

桦褐孔菌[Inonotusobliquus(Ach.exPers.)Pilát]，又名斜生纤孔菌[1]，俗称茶卡(Chaga)，是一种极其耐寒的药用真菌，具有抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、抗诱变[4]、抗炎[5]、止痛[6]、抗菌[7]、抗黑色素形成[8]和提高机体免疫能力[9]等多种功能。珍贵的桦褐孔菌野生品种只有在活的桦树上生长10～15年才具有很好的药用价值[10]。近些年，随着人们对桦褐孔菌的认知程度不断提高，有限的桦褐孔菌野生资源被大量开采，虽然桦褐孔菌菌核的人工栽培已取得成功，但因其生物学效率低，不能进行规模化生产，所以目前仍满足不了人们的需求。研究表明，菌核的生长与胞外酶的活性密切相关，纤维素酶是桦褐孔菌生长发育过程中产生的胞外酶，因其参与纤维素的水解过程，对食用菌培养料的分解具有重要作用，因此研究纤维素酶在桦褐孔菌菌核形成期的分泌表达具有重要意义。

纤维素酶包括隶属于葡萄糖苷水解酶家族的外切葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanases,EC)、内切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase,EG)和β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BGL)。内切葡聚糖酶作用于纤维素，能够随机切割纤维素长链内部的非结晶区，降低纤维素结构的完整性，使其水解产生一定量的小分子多糖[11-12]。β-葡萄糖苷酶能够水解可溶性的纤维寡糖或纤维二糖产生葡萄糖[13]。在实际生产中，β-葡萄糖苷酶经常被添加到由真菌分泌的降解纤维素的酶复合物中来提高降解木质纤维素过程的糖化效率，从而减少纤维二糖的积累及其对酶解过程的反馈抑制[14]，因此，增强纤维素酶体系中β-葡萄糖苷酶的活力，是提高纤维素水解率和葡萄糖产量的关键措施之一。许多研究表明，子实体发育过程中内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性明显升高，认为子实体的发育与内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活性存在一定的相关性。

桦褐孔菌纤维素酶基因在原核生物中的表达本课题组安丹丹在前期已做了充分的研究，但原核表达的蛋白在各种酶的作用下易被大量降解而使产量明显降低，并且原核表达的蛋白没有经过修饰，不具有天然的活性；真核表达的蛋白经过修饰以后可以产生类似天然的蛋白，具有相应的功能，因此该实验室在成功构建原核表达载体后进行了真核表达载体的构建，为后续桦褐孔菌菌核发育过程中纤维素酶基因的功能验证奠定了基础。

1 材料与方法

1.1材料

桦褐孔菌JL01菌株由延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室保存并提供；

pPICZαA(Invitrogen)、限制性内切酶(Fermentas)、T4DNA连接酶(Takara)、2×Taq Master Mix(Dye Plus)、2×Ultra-pfu Mix(Dye Plus)、DL 2 000 bp Marker、DL 5 000 bp Marker、PCR产物回收试剂盒，其它试剂均为国产分析纯。

1.2引物设计

根据安丹丹等[15]克隆得到的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶基因，利用Primer5.0软件设计特异性扩增引物EG(F)、EG(R)、BGL(F)和BGL(R)扩增目的基因，其中EG(F)、BGL(F)下划线部分为EcoRI酶切位点，EG(R)、BGL(R)下划线部分为NotI酶切位点，小写字母为载体pPICZαA上的1小段序列。另外，合成1对鉴定菌液的通用引物P1、P2，引物如下：

EG(F):5，-CATGGAATTCATGCAACAATCGCTTTATGGTCAAT-3，

EG(R):5，-CATGGCGGCCGCTCAATGATGATGATGATGATGTGGAAGGTTCGGCTTGATAG-3，

BGL(F):5，-gagaggctgaagctgaattcATGGCCCCTTCCGATTTTGC-3，

BGL(R):5，-tctagaaagctggcggccgcTTAATGATGATGATGATGATGCAGCCCATTCCACTCAAAAG-3，

P1:5，-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3，

P2:5，-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3，

1.3内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶基因扩增

以安丹丹等[15]已测序正确的质粒18T-eg2和18T-bgl2为模板，PCR扩增基因全长序列。命名为IoEG和IoBGL。PCR扩增体系(50 μL)：2XUltra Pfu Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 22 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸，35个循环，最后72 ℃延伸5 min。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后，按照胶回收试剂盒纯化回收。将扩增的基因与pMD18-T载体连接，再经过转化大肠杆菌感受态细胞、质粒鉴定，对获得的阳性质粒进行序列测定。

1.4酵母表达载体构建

将测序正确的阳性质粒与载体pPICZαA用EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶回收目的片段，将目的基因分别与线性化的pPICZαA连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布Zeocin抗性LB平板，37 ℃过夜培养，挑取转化子接种LB液体培养基，37 ℃，160 r/min，培养4 h，取3 μL菌液作为PCR菌检的检测模板，用特异性引物P1、P2进行PCR鉴定，之后送北京三博远志生物技术有限公司测序。

1.5酵母表达载体转入酵母细胞

通过高效电转化法将限制性内切酶PmeI线性化的重组表达载体pPICZαA-EG和pPICZαA-BGL分别转入感受态毕赤酵母GS115中。取转化的菌液上清均匀涂于YPD培养基(含Zeocin)中，30 ℃培养2～3 d，挑取白色单菌落于YPD液体培养基中，30 ℃，200 r/min，过夜培养，取400 μL菌液，10 000 r/min离心2 min，弃上清，用200 μL无菌水重悬细胞。10 000 r/min离心2 min，弃上清，用40 μL TE重悬细胞，置于100 ℃水浴10 min，立即冰上孵育10 min，10 000 r/min离心10 min，取上清作为PCR菌检模板，用特异性引物P1、P2进行PCR鉴定。

2 结果与分析

2.1目的基因IoEG、IoBGL的克隆

以安丹丹等[15]已测序正确的质粒18T-eg2和18T-bgl2为模板，利用所设计的引物进行PCR扩增，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，获得的IoEG(图1)和IoBGL(图2)基因大小与预期相一致。

M:DNA分子量 1～3:目的基因IoEG

M:DNA分子量 1～4:目的基因IoBGL

2.2真核表达载体的鉴定

真核表达载体pPICZαA-EG和pPICZαA-BGL经转化大肠杆菌感受态细胞克隆后，以其阳性克隆质粒为模板，IoEG挑取12个转化子，检测到3个阳性转化子(图3)，PCR扩增出IoEG长度1 375 bp(包含部分载体片段)；IoBGL挑取12个转化子，检测到10个阳性转化子(图4)，PCR扩增出IoBGL长度2 857 bp(包含部分载体片段)，片段长度与预期一致，说明目的基因IoEG和IoBGL已插入表达载体pPICZαA中，重组质粒pPICZαA-EG和pPICZαA-BGL构建成功。

M:DNA分子量 3、8、12：重组质粒pPICZαA-EG的目的片段 1、2、4、5、6、7、9、10、11：未检测到目的片段

图3重组质粒pPICZαA-EGPCR鉴定

Fig.3PCRidentificationofrecombinantplasmidspPICZαA-EG

M:DNA分子量 1、3～11：重组质粒pPICZαA-BGL的目的片段 2、12：未检测到目的片段

图4重组质粒pPICZαA-BGLPCR鉴定

Fig.4PCRidentificationofrecombinantplasmidspPICZαA-BGL

2.3转化酵母菌的鉴定

酵母菌PCR鉴定结果显示，扩增出了IoEG长度1 375 bp，IoBGL长度2 857 bp的条带(图5，6)，与预期长度相一致，说明重组表达载体已经成功整合到毕赤酵母GS115的染色体上。内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶序列比对如图7，8。

M:DNA分子量 1～4：重组质粒pPICZαA-EG转化毕赤酵母GS115菌检扩增目的片段

图5重组质粒pPICZαA-EG转化酵母菌PCR鉴定

Fig.5IdentificationofrecombinantplasmidpPICZαA-BGLintoPichiapastorisGS115byPCR

M:DNA分子量 1～4：重组质粒pPICZαA-BGL转化毕赤酵母GS115菌检扩增目的片段

图6重组质粒pPICZαA-EG转化酵母菌PCR鉴定

Fig.6IdentificationofrecombinantplasmidpPICZαA-BGLintoPichiapastorisGS115byPCR

Sequence1：扩增序列；Sequence2：载体构建菌检序列；Sequence3：GS115菌检序列

Sequence1：扩增序列；Sequence2：载体构建菌检序列；Sequence3：GS115菌检序列

3 讨论

研究表明，纤维素酶活性与子实体发育密切相关。Claydon等[16]研究双孢菇时发现，胞外纤维素酶活性越高，子实体产量也越高。赵丽等[17]研究发现，桦褐孔菌菌核形成过程中主要以分解非木质素类物质为主要营养来源，菌核形成时期一定的纤维素酶活性是影响其菌核产量的决定性因素。Ding等[18]从分子水平研究了β-葡萄糖苷酶基因在草菇子实体发育过程中的表达量变化规律，表明β-葡萄糖苷酶基因与子实体发育之间存在调控关系。隋飞飞等[19-20]通过实时荧光定量PCR分析表明，随着桦褐孔菌菌核的生长发育，内切葡聚糖酶基因的表达量不断升高，β-葡萄糖苷酶基因的表达量呈先上升后下降的趋势，证明了内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶基因的表达量与桦褐孔菌菌核的产量有一定的相关性。综上，内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶基因与菌核的生长发育密切相关，因此，深入研究其对菌核发育的作用机制具有重要意义。

大肠杆菌作为宿主表达重组蛋白因其缺少翻译后的修饰、加工，不能产生类似于天然蛋白质的复杂结构，从而影响蛋白功能的活性。目前用于生产重组蛋白的毕赤酵母表达系统因其表达量高，操作简单，适合大规模的工业化生产而逐渐被大家认可。本研究构建了桦褐孔菌内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶真核表达载体[21-24]，成功将其转化入毕赤酵母GS115中，获得了桦褐孔菌内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶酵母表达体系，为下一步蛋白的表达和蛋白功能的深入研究奠定了基础。对桦褐孔菌纤维素酶基因及其功能的研究，可以为了解桦褐孔菌纤维素酶基因在其菌核形成过程中的作用提供依据，进而可以研究其作用机制，以提高菌核产量，为将来基因工程育种提供理论依据。

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ConstructionofeukaryoticexpressionvectorofcellulasegeneofInonotusobliquus

ZHANG Yuting, QU Baihong, NING Yunshan, AN Dandan, LI Jian, CHEN Yanqiu*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity，YanjiJilin133002,China)

A pair of specific primers with viscous terminal cleavage sites EcoRI and NotI were designed according to the known full length sequence ofendo-l,4-β-D-glucanaseandbeta-glucosidasegene ORF.PCR was used to clone the full length of ORF gene ofendo-l,4-β-D-glucanaseandbeta-glucosidase. The target fragments were ligated with the eukaryotic expression vector pPICZαA respectively.The eukaryotic expression vectors pPICZαA-EG and pPICZαA-BGL were constructed and ligated into the Pichia pastoris GS115, which laid the foundation for the next step in cellulase expression and functional validation.

Inonotusobliquus;endo-l,4-β-D-glucanase;beta-glucosidase; eukaryotic; vector construction

2017-04-23

国家自然科学基金项目(31160408和31460536)

张宇婷(1991— )，女，吉林吉林人，在读硕士，研究方向为生物技术在食药用真菌中的应用。陈艳秋通信作者，

E-mail:cyq326@126.com

1004-7999(2017)03-0001-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.001

S646

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