东北刺人参不定根对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞促炎介质的影响

李 贺， 姜 君， 蒋晓龙， 刘冠甫, 廉美兰, 朴炫春

(延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林 延吉 133002 )

东北刺人参不定根对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞促炎介质的影响

李 贺， 姜 君， 蒋晓龙， 刘冠甫, 廉美兰, 朴炫春*

(延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林 延吉 133002 )

东北刺人参是五加科兼具观赏和药用价值的珍贵濒危植物。为了促进东北刺人参产品的开发，在抗炎相关产品生产中以不定根代替短缺的野生植株作为植物材料。该研究利用诱导子未处理和处理的生物反应器培养的东北刺人参不定根水提物处理小鼠腹腔巨噬细胞，通过检测巨噬细胞中一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子-(TNF-)及白细胞介素-1(IL-1)3种促炎介质的水平，探明不定根的抗炎活性。研究表明：2种东北刺人参不定根提取物中总酚和总黄酮含量有很大差异，诱导子处理的不定根水提物(E 2)中总酚含量是诱导子未处理不定根水提物(E 1)的3.2倍，而总黄酮含量是2.7倍。2种不定根提取物对NO和TNF-及IL-1的影响不同，E2对3种促炎介质均有显著的抑制作用，但E1只抑制NO的生成，对TNF-及IL-1没有影响，E2的抗炎效果高于E1。因此，今后在进行抗炎相关产品生产中，可利用在生物反应器培养中经诱导子处理的东北刺人参不定根作为原材料。

不定根；诱导子；巨噬细胞；促炎介质

东北刺人参(OplopanaxelatusNakai)又名刺参，五加科多年生落叶灌木，属于国家二级保护植物，是兼具观赏和药用价值的珍贵植物[1]。东北刺人参分布区域较狭窄，国内主要分布于吉林省长白地区，国外仅在朝鲜和俄罗斯有少量分布[2]。东北刺人参具有极高的药用功效，对神经衰弱、低血糖、糖尿病、心血管病、风湿等疾病有一定疗效，并具有抗氧化、抗真菌、抗炎和抗癌[3-5]等作用。然而，近年来东北刺人参野生资源遭到严重破坏，且人工栽培体系尚未建立，植物材料严重短缺，因此，对东北刺人参的活性及其成分分离等方面研究的开展面临困难，导致产品的开发和生产也受到限制。针对这些问题，采用植物细胞培养工程手段，将培养的细胞、组织或器官作为新植物材料源应用于产品生产中具有重要意义。目前，利用生物反应器大量培养植物细胞生产代谢产物的技术受到越来越多的关注，已报道的有贯叶连翘[6]、紫锥菊[7]等多种植物。东北刺人参的不定根生物反应器的培养方法方面，我们团队进行了研究报道[8-9]。与其他生物活性研究受限一样，目前尚无东北刺人参抗炎方面的研究报道。因此，该研究利用生物反应器培养的东北刺人参不定根提取物处理小鼠腹腔巨噬细胞，通过检测巨噬细胞产生的一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子-(TNF-)及白细胞介素-1(IL-1)等促炎介质水平，初步探明东北不定根的抗炎活性，为今后东北刺人参抗炎特性和机制研究及其相关产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

按李慧娟等[10]的方法用东北刺人参无菌播种苗诱导并增殖不定根。

1.2药品

DMEM培养基和胎牛血清(FBS)(Gibco公司，美国)、青霉素、链霉素和3-(4,5-二甲基噻唑-2 ) -2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(Sigma公司，美国)，IL-1β抗体(Cell Signaling Technology公司，美国)，脂多糖(LPS)和ATP(Invivogen公司，美国)，茉莉酸甲酯(Sigma，美国)，没食子酸(上海远慕生物科技有限公司，中国)和芦丁(北京索莱宝科技有限公司，中国)。其余试剂均为市售分析纯。

1.3仪器

酶联免疫检测仪(UV-2600，日本岛津公司，日本)，蛋白质电泳及转印设备(Bio-Rad公司，美国)，凝胶成像仪(LAS-3000，Fujifilm公司，日本)。

1.4动物

8周龄体重为(22±4) g的C57BL/6雌性小鼠，购于长春亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证编号为SCXK(吉) -2011-0004。试验前，将小鼠置于25 ℃，相对湿度(50±5)%的环境中进行适应性喂养，给予食物并自由饮水。试验均符合动物伦理委员会标准。

1.5方法

1.5.1 不定根提取物的制备及其总酚和总黄酮含量的测定

将东北刺人参不定根切成约1 cm大小后，接种至5 L气升式反应器中，接种量为5 g/L。反应器中加入4 L培养基不定根增殖生长培养基(MS+IBA 3 mg/L+蔗糖50 g/L，pH值5.8)，通入75 mL/min的气体，在温度约为25 ℃的条件下暗培养。不定根在反应器中培养30 d后，以茉莉酸甲酯(200M)作为诱导子，用滤膜(0.45m)滤菌后加入到培养基中处理8 d，培养天数共38 d的不定根和未加入茉莉酸甲酯培养38 d后收获的不定根放置于45 ℃恒温箱中烘干至恒重。将烘干的不定根样品磨碎后，取15 g浸泡在200 mL的蒸馏水中超声1 h后过滤，将收集的滤渣重复超声2次，3次滤液合并后，45 ℃下进行真空减压干燥(R206，上海慎科学技术有限公司，中国上海)，得到诱导子处理(E 1)和未处理(E 2)的两种不定根提取物，放置于4 ℃下贮藏，备用。

将不定根提取物用70%乙醇溶解，并稀释5 000倍后，以没食子酸作为标准品利用紫外分光光度计于波长760 nm处测定总酚含量，而总黄酮含量以芦丁作为标准品在510 nm处测定。

1.5.2 巨噬细胞的获取

C57BL/6小鼠腹腔注射4%的2 mL巯基醋酸盐培养液，4 d后获得腹膜渗出细胞。将细胞培养在含10%FBS和抗生素(100 U/mL 青霉素和100g/mL 链霉素)的DMEM培养基中，在37 ℃和5%CO2的培养箱中孵育，过夜后去除上清液，获得巯基醋酸盐诱导的巨噬细胞。

1.5.3 不定根提取物对巨噬细胞活力的影响

将巨噬细胞接种于96孔板中，每孔细胞密度为8×104个。将2种不定根提取物E 1和E 2用二甲基亚砜(DMSO)溶解后，配置成25、50、100和200g/mL 4种不同浓度后处理巨噬细胞，孵育8 h后弃去培养基，并在每孔加入含有MTT(500g/mL)的DMEM培养基100L，在37 ℃和5%CO2下孵育4 h，弃去培养基。之后，每孔加DMSO溶解甲臜，用酶联免疫检测仪波长550处测吸收度，检测提取物的细胞毒性，确定进一步抗炎活性试验中的提取物浓度。

1.5.4 促炎介质水平的测定

将巨噬细胞接种于48孔板中，每孔的细胞密度为2.5×105个，并于培养箱(37 ℃和5%CO2)中孵育12 h后，将培养基弃掉，加入25、50和100g/mL的不定根提取物，未用提取物处理的加入DMEM培养基做为空白和对照组，孵育1 h后，提取物处理组和对照组中加入0.1g/mL LPS，空白组不加LPS。为了测定促炎介质NO的释放量，在LPS刺激24 h后，取细胞上清液，采用Griess还原法于酶标仪450 nm处测定吸光值(OD)。促炎因子TNF-α的释放量于LPS刺激6 h后，取细胞上清液，利用ELISA试剂盒，按照说明书操作，在酶标仪450 nm处测定。

为了测定促炎因子IL-1β蛋白水平，在48孔板中每孔加入2.5×105个巨噬细胞后，于37 ℃和5% CO2下孵育12 h，弃培养基，加入0.1g/mL LPS刺激3 h后，加入不同浓度的不定根提取物处理1 h，再加入5 mM ATP处理1 h后，离心取上清液。蛋白质经12% SDS-PAGE电泳分离后，用300 mA电流将蛋白质转移到PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭1 h，并用IL-1β抗体(1∶1 000，4 ℃)中孵育过夜。最后，与HRP标记的二抗(1∶ 5 000，室温)进行反应，并用ECL化学发光法显影(LAS-3000)。

1.5.5 数据分析

试验数据为平均值±标准差，利用Graphpad Prism 5软件程序，采用t测验对数据进行比较。

2 结果与分析

2.1不定根提取物中总酚及总黄酮的含量

利用生物反应器进行东北刺人参不定根培养时，为了提高不定根中活性物质含量，在培养30 d后加入诱导子处理8 d，所获得的不定根的生物量与未经诱导子处理培养38 d的不定根无明显差异，每个反应器均可得到约50 g不定根干品(数据没显示)。对2种不定根水提物中总酚和总黄酮含量进行测定的结果，E2中总酚和总黄酮含量均高于E1，总酚含量为E1的3.2倍，总黄酮为2.7倍(表1)。说明在生物反应器培养过程中利用诱导子处理东北刺人参不定根可提高活性物质的含量。东北刺人参2种不定根提取物因所含的酚和黄酮含量不同，在进一步的抗炎活性试验中可能会产生不同的效果。

表1 东北刺人参2种不定根水提物中总酚和黄酮的含量

注：E1为反应器培养38 d的不定根水提物，E2为反应器培养30 d后诱导子处理8 d的不定根水提物，下同；与E 1比较，*P<0.05

2.2东北刺人参不定根提取物对巨噬细胞活性的影响

为了探明2种不定根水提物的抗炎活性，通过检测不同浓度的提取物对小鼠巨噬细胞活性，确定了无毒性的提取物浓度用于进一步的试验。由图1可知，用25～200 μg/mL不定根提取物处理后，小鼠巨噬细胞的活性未出现抑制现象，说明此浓度范围内的不定根提取物无毒性，在抗炎活性试验中提取物浓度选择低于200 μg/mL即可。

注：E1为反应器培养38 d的不定根水提物，E2为反应器培养30 d后诱导子处理8 d的不定根水提物

图1东北刺人参不定根提取物对细胞活性的影响
Fig.1EffectofO.elatusadventitiousrootextractsoncellviability

2.3东北刺人参不定根水提物对促炎介质水平的影响

E1：为反应器培养38 d的不定根水提物；E2：为反应器培养30 d后诱导子处理8 d的不定根水提物；与LPS组比较，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

图2东北刺人参不定根提取物对小鼠腹腔巨噬细胞NO和TNF-释放量的影响

Fig.2EffectofO.elatusadventitiousrootextractsonNOandTNF-productionofPMs

E1：为反应器培养38 d的不定根水提物，E2：反应器培养30 d后诱导子处理8 d的不定根水提物；与LPS组比较，**P<0.01

图3东北刺人参不定根提取物对小鼠腹腔巨噬细胞IL-1分泌的影响

Fig.3EffectofO.elatusadventitiousrootextractsonIL-1βproductionofPMs

3 讨论与结论

将生物反应器培养的植物细胞、组织或器官作为原材料用于相关产品生产中是解决植物材料短缺的有效方法[11-13]。然而，欲使反应器培养的植物材料中活性物质生产量达到较高水平，在培养条件优化的基础上，使用诱导子最为有效。诱导子作为一种常用的非生物诱导子已在许多植物种的细胞和器官培养中得以应用，并发现其具有良好的促进活性物质积累的效果[14-16]。本研究中，东北刺人参不定根在生物反应器中培养30 d后，加入诱导子处理8 d，所得到的不定根中总酚和总黄酮含量显著高于未经诱导子处理的不定根。可见，诱导子的使用是东北刺人参不定根生物反应器培养过程中提高活性物质含量的一个重要的措施。

东北刺人参作为具有极高药用价值的珍稀植物，具有多种生物活性。然而，比起其它五加科植物，因资源的严重短缺，东北刺人参的相关研究受到阻碍，使得产品开发和生产受到限制[17]。 在东北刺人参抗炎方面的研究几近空白的状态下，该研究所进行的东北刺人参不定根抗炎活性的初步研究，对于今后进一步开展其抗炎特性和机制的研究及其相关产品的开发和生产具有极高的参考价值。研究发现：诱导子处理和未处理的2种不定根水提物对小鼠巨噬细胞的NO和促炎因子TNF-及IL-1的产生具有不同程度的抑制效果，诱导子处理的不定根水提物(E2)抑制NO、TNF-及IL-1的效果显著，高于未经诱导子处理的不定根水提物(E1)。这可能与E2中含有的酚及黄酮含量多于E1有关，这种结果与许多研究所阐述的酚和黄酮具有抗炎作用相吻合[18-19]。因此，诱导子处理的不定根可用于东北刺人参抗炎相关产品的生产中，但对不定根的提取方法及抗炎特性及机制等方面需进行进一步的深入研究。

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EffectofOpolopanaxelatusNakaiadventitiousrootsonthelevelsofpro-inflammatorymediatorsinmacrophagesinducedbyLPS

LI He, JIANG Jun, JIANG Xiaolong, LIU Guanpu, LIAN Meilan, PIAO Xuanchun*

(KeyLaboratoryofNaturalResourcesofChangbaiMountain&FunctionalMoleculesofMinistryofEducation,YanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

OplopanaxelatusNakai is a plant of Araliaceae with ornamental and medicinal values. To promote the product development ofO.elatus, the adventitious roots replaced the field grown plants in the anti-inflammatory production. In the present study, the water extracts ofO.elatusadventitious roots, which cultured with the untreated bioreactor (E1) and the treated bioreactor with an elicitor (E2), was used to treat the peritoneal macrophages of the mice. The anti-inflammatory activity was investigated by measuring the levels of NO, TNF-, and IL-1β. In the water extracts of the E1 group and the E2 group, the total phenol and total flavonoid contents was different. The total phenol and the flavonoid contents in E2 group were 3.2 fold and 2.7 fold more than that in the E1 group. The effect of the both extracts on the production of NO, TNF-, and IL-1β was also different, three pro-inflammatory mediators were all inhibited by the E2 group, while only NO was inhibited by the E1 group; the anti-inflammatory activity of the E2 group was higher than that of the E1 group. Consequently, bioreactor cultured adventitious roots treated with elicitor can be used in the anti-inflammatory production ofO.elatusin the future.

adventitious root; elicitor; macrophage; pro-inflammatory mediator

2017-04-11

国家自然科学基金项目(31260182和31660080)

李贺(1991—)，女，吉林松原人，在读硕士，研究方向为植物组织培养及生物反应器的应用。朴炫春为通信作者，

E-mail: mllian@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)03-0013-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.003

R285.5

A