桑黄多糖对Ⅰ型糖尿病小鼠模型的影响

史得君， 崔清美， 齐 欣， 崔承弼*， 陈兆双

(1.延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室；2.延边大学农学院:吉林 延吉 133002；3.长白山科学研究院，吉林 安图 133600)

桑黄多糖对Ⅰ型糖尿病小鼠模型的影响

史得君1,2， 崔清美2， 齐 欣2， 崔承弼1,2*， 陈兆双3*

(1.延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室；2.延边大学农学院:吉林 延吉 133002；3.长白山科学研究院，吉林 安图 133600)

为确定桑黄多糖对Ⅰ型糖尿病小鼠模型的影响，以链脲佐菌素(STZ)建模的I型糖尿病(DM)昆明种(KM)小鼠为研究对象，探究了不同剂量桑黄多糖(低剂量20 mg/kg·BW，中剂量40 mg/kg·BW，高剂量80 mg/kg·BW)对其影响。结果表明：STZ造模的KM小鼠糖尿病模型症状有所改善，具体表现为，试验第3周时，高剂量组小鼠均重达到36.17 g显著高于糖尿病模型组(P<0.05)，增长了17.89%，更接近空白组，据观察，饮水量亦有所下降；且高剂量组小鼠血糖值显著低于糖尿病组(P<0.05)，下降了23.96%。同时，试验末期高剂量组葡萄糖耐量(OGTT)与糖尿病组相比显著改善(P<0.05)，提升了31.02%；而对于脏器指数，高剂量组肝脏指数显著高于糖尿病组(P<0.05)，提升了55.03%，而肾脏指数高、中、低剂量组间无显著性差异，但均显著高于糖尿病组(P<0.05)。因此,高剂量桑黄多糖提取物有助于I型糖尿病模型鼠的症状改善。

桑黄；桑黄多糖；Ⅰ型糖尿病；降血糖；脏器系数

桑黄(Phellinussigniarius)别名又称桑臣、桑耳[1]，属担子菌亚门、层菌纲、多孔菌目、多孔菌科、针层菌属。多见于杨、松、桑、白桦、杜鹃等树上，会造成树芯白腐。近年来，有关桑黄药理活性的研究已经引起很多国内外保健品行业和医药工业专家的广泛关注，甚至在东亚的部分国家桑黄制品已经获准进入市场，并拥有可观的前景。目前国内外对于桑黄药理活性的研究多集中在抑制肿瘤细胞生长和调节免疫能力方面，而对桑黄的其他特性，如抗菌、降血糖、抗突变等作用少有报道[2]。

随着我国人民生活水平提高、劳动强度减少以及生活方式的改变，糖尿病发病状况愈演愈烈，现已成为全球3大慢性非传染疾病之一。我国是全球糖尿病患者人数最多的国家，2013年国际糖尿病联盟(IDF)统计数据显示，我国20～79岁的糖尿病患者为0.98亿[3]，预计到2035年该数据将增至1.43亿[4]。在我国，糖尿病已成为多发病和常见病，其患病率高达9.7%，尤其是40岁以上的中、老年人更高，并有明显上升趋势，且官方数据显示到2025年，全球糖尿病发病人群将高达3.33亿人次[5]。鉴于糖尿病的严重性，亟需对人体无负担且能防止高血糖的天然保健食品，而能够达到这些要求的首选无疑是更易被接受且毒副作用更小的天然提取物中的降糖成分。因此，受中国中草药的启发，近年来世界范围内越来越多的专家学者开始研究各种植物及菌体中的天然降糖物质[6-7]，如降血糖类的苦荞保健饮料及保健品胶囊等产品[8-9]。对于历史悠久的桑黄，虽然也有着良好的降血糖作用，但相关研究还较少。

本研究为了验证桑黄多糖对I型糖尿病小鼠模型的作用，采用不同剂量的桑黄多糖提取物为试验受试物，对链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)诱导造模的 Ⅰ 型糖尿病小鼠进行灌胃试验，研究其降血糖及改善脏器指数等效果，为桑黄多糖的利用提供依据。

1 材料与方法

1.1试验动物及饲养条件

KM种小鼠：25只，SPF级，体重20±2 g左右，雄性；动物饲养于定时交换空气(6次/h)、恒温(20～25 ℃)、定时适当亮度的照明(7:00-19:00)、相对湿度55%～65%的延边大学吉林省朝鲜族公共食品研发中心动物实验室,适应7 d。期间小鼠自由摄食、饮水。

1.2试验试剂

桑黄粉末：2015年长白山杨树桑黄(粉碎、过40目筛)，长白山科学研究院提供；链脲佐菌素(购自Sigma公司，纯度≥98.0%)等。

1.3方法

1.3.1 造模剂(STZ溶液)配制

1) 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 A液：取柠檬酸(FW:210.14) 0.21 g溶于10 mL双蒸水；B液：取柠檬酸钠(FW:294.10) 0.294 g溶于10 mL双蒸水。A、B液按1∶1混合，调节pH值至4.3～4.4。

2) 链脲佐菌素配制液 以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解STZ，注射剂量为100 mg/kg·BW，并在30 min内完成注射。

1.3.2 桑黄多糖提取

采用参考文献[10]及前期试验优化的提取方法提取桑黄多糖，即桑黄粉末按1∶18料液比，90 ℃，水提8 h，滤渣重复提取1次，收集并合并提取液，真空浓缩滤液至原体积1/5，然后加入3倍体积的无水乙醇，于冰箱中静置24 h，之后5 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀用75%乙醇洗涤3次，合并沉淀，60 ℃真空干燥成桑黄多糖，多糖得率2.15%，多糖含量以葡聚糖计量为20%左右。

1.3.3 I型糖尿病小鼠建模及分组

适应性喂养7 d后的雄性KM小鼠随机选取25只，禁食12～16 h，随机选取5只为空白组，腹腔注射1.3.1(1)中缓冲溶液，剩余20只按照剂量腹腔注射STZ，注射4 h后灌胃5%葡萄糖溶液度过低血糖期后喂食，7 d后，测定小鼠空腹血糖值，建立I型糖尿病模型(以禁食12 h，空腹血糖大于200 mg/dL或随机血糖值大于300 mg/dL为准)。

随后将小鼠按体重随机分为4组：糖尿病组、高剂量组(桑黄多糖80 mg/kg·BW)、中剂量组(桑黄多糖40 mg/kg·BW)、低剂量组(桑黄多糖20 mg/kg·BW)；除空白对照组、糖尿病组以蒸馏水灌胃外，治疗组分别以高、中、低剂量桑黄多糖溶液连续灌胃3周。

1.3.4 小鼠体重及空腹血糖的测定

试验过程中每天观察并记录小鼠进食量、饮水量的变化，每周间隔3 d测定小鼠体重和空腹(禁食6 h)血糖[11]。

1.3.5 口服葡萄糖耐量试验(OGTT)

试验第3周末，以剂量75 mg/kg·BW 1次性经口给予小鼠葡萄糖，20 min后尾静脉采血测定给葡萄糖后0、30、60、90和120 min的血糖值[12]。

1.3.6 脏器系数

试验后小鼠脱颈处死，取其肾、脾、肝、心脏并测湿重。

1.3.7 统计分析

统计分析采用SPSS Statistics 19.0进行单一因素试验的多重比较，结果以X±S表示。以P<0.05为差异性显著；P>0.05为差异性不显著。

2 结果与分析

2.1桑黄多糖对Ⅰ型糖尿病小鼠身体状态的影响

经过3周的喂养，桑黄多糖的高、中、低剂量组小鼠的毛发相对于糖尿病组的小鼠而言恢复顺滑体型、重新变得丰满，多饮多尿的现象也相对减轻。解剖后观察内脏，发现糖尿病组小鼠内脏周围存在脂肪，而桑黄多糖高、中、低剂量组小鼠内脏略鲜亮，且3个剂量组中，高剂量组内脏状态更接近空白组，中低剂量组有不同程度差异，低剂量组内脏状态最次，仅稍优于糖尿病组。说明桑黄多糖可以降低糖尿病小鼠的体内氧化应激反应，利于脂肪代谢，同时提升摄食的利用率，降低糖异生作用。表明桑黄多糖对I型糖尿病小鼠身体状态的缓解起到了良好的作用。

2.2桑黄多糖对Ⅰ型糖尿病小鼠体重的影响

由表1可知，空白组小鼠体重随着试验时间的增加一直呈现递增趋势，而造模组小鼠体重在造模前后体重未增加或轻微增加且同时期体重较空白组均显著降低(P<0.05)，对于造模后各组小鼠体重除空白组外彼此存在一定差异的原因可能是在进行腹腔注射时由于STZ溶液易快速分解而注射顺序的先后导致了小鼠体内有效STZ含量的轻微差异。在试验的后2周，空白组小鼠体重显著高于糖尿病组及桑黄多糖治疗组小鼠(P<0.05)，且在第2周时，各组小鼠体重均存在显著性差异，呈现空白组>高剂量组>中剂量组>低剂量组>糖尿病组的特点，而随着试验进行到第3周时，高剂量组体重显著高于低剂量组(P<0.05)，且中剂量组介于高剂量组与低剂量组之间，虽然高剂量组体重与空白组差异显著，但较中、低剂量组更接近空白组。证明高剂量桑黄多糖能够很好地恢复糖尿病小鼠体重减轻的情况，表明桑黄多糖具有促进糖尿病小鼠体重恢复的作用。

表1 桑黄多糖对糖尿病小鼠体重的影响

注：同一列凡有相同字母的即为差异不显著，不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

2.3桑黄多糖对Ⅰ型糖尿病小鼠空腹血糖值的影响

由表2可知,造模成功的Ⅰ型糖尿病小鼠，其自身胰岛功能受损，胰岛素分泌不足，且伴随胰岛素抵抗，使自身对胰岛素利用不敏感。试验初期，5组小鼠的血糖均正常，而造模成功之后，模型组小鼠的血糖显著高于空白组(P<0.05)，均大于200 mg/dL,但无显著性差异，且由于没有给予糖尿病组小鼠任何降血糖的措施，其血糖在试验期一直呈现出上升的趋势，而3个治疗组小鼠血糖在灌胃桑黄多糖之后有下降趋势，且第3周时中、高剂量组血糖值显著低于低剂量组(P<0.05)，说明桑黄多糖有利于糖尿病小鼠血糖的恢复且存在剂量效应关系，其中,高剂量组最明显。

2.4桑黄多糖对Ⅰ型糖尿病小鼠OGTT的影响

对于健康机体而言，给糖后，0～30 min血糖浓度迅速上升，随后开始下降并恢复至空腹水平。如果服食糖后90 min其血糖值未恢复到正常水平，尿糖阳性，说明糖耐量降低。

桑黄多糖灌胃3周后的OGTT结果如表3所示。开始(0 min)时空白组小鼠血糖值与糖尿病组有显著性差异(P<0.05)；随着时间推移，在30、60和90 min时，桑黄多糖提取物低剂量组与高剂量组相比存在显著性差异，且3个不同剂量桑黄多糖治疗组均显著低于糖尿病组(P<0.05)，最终在120 min时，桑黄多糖高剂量组血糖值降低到200 mg/dL以下，显著低于糖尿病及中、低剂量治疗组，表明桑黄多糖对STZ诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠耐糖性有一定恢复作用。

2.5桑黄多糖对Ⅰ型糖尿病小鼠脏器系数的影响

桑黄多糖灌胃3周后脏器占体重的比例如表4所示。糖尿病治疗组小鼠脾脏、心脏的湿量与糖尿病组相比无显著差异。但是可以看出，中、高剂量治疗组肝脏脏器系数显著高于糖尿病组(P<0.05)，同时治疗组的肾脏脏器系数显著高于糖尿病组(P<0.05)，证明桑黄多糖能够显著改善I型糖尿病小鼠的肝脏及肾脏损伤,对于糖尿病引起的内脏损伤具有保护作用。

(g/100 g·BW)

3 讨论与结论

糖尿病最常见的几种症状中，“三多一少”是基础表现，其原因为葡萄糖氧化障碍，致使机体供能不足，导致饥饿多食；然后引发血糖升高，血糖值超过肾糖阈时发生尿糖，糖随尿液的大量排出引起多尿；多尿引起失水过多，血液浓度升高而口渴，最终多饮成为一个死循环。而与此同时，葡萄糖氧化障碍会大量动员体内脂肪及蛋白质，增大能量消耗，身体逐渐消瘦，体重减轻[13]。I型糖尿病人体内胰岛素绝对不足，不能充分利用葡萄糖，需要外源补充胰岛素，因此,机体就更需要能源物质来供应能量及热量，这样一来蛋白分解增强，体内环境呈负氮平衡，体重愈加消瘦，而II型糖尿病机体胰岛素相对不足通常会伴随肥胖，临床首选用药二甲双胍可以通过促进机体糖的无氧酵解和降低组织糖异生作用来缓解相关症状[14]。

除了以上外在表现外，糖尿病患者均较正常人群血糖值偏高，并且由于日益严重的患病形势，与糖尿病紧密相关的代谢机制也越来越多的被阐明，其中较为主流的降血糖机制包括5种：1) 通过增加机体内胰岛素受体(InsR)表达而提升其含量或提升机体胰岛素受体(InsR)亲和力以增强胰岛素的利用和其能力的发挥以降低高血糖；2) 通过调节糖代谢途径中关键酶的活性，例如葡萄糖激酶等以增强葡萄糖的氧化分解从而降低体内血糖浓度；3) 通过增强机体或组织的抗氧化能力，避免胰岛组织中胰岛B细胞因氧化应激损伤，保证胰岛素的正常分泌而维持机体降血糖功能的正常运转；4) 通过抑制胰岛B细胞的凋亡，增加机体胰岛B细胞的数量同时延长胰岛B细胞分泌胰岛素的功能而发挥降血糖作用，改善高血糖症状[15]；5) 通过拮抗肾上腺素、胰高血糖素等升血糖激素的作用，使降血糖作用大于升血糖作用，实现降低机体血糖。

研究发现，糖尿病会引起机体糖代谢关键酶的紊乱从而引发自由基过剩和氧化应激反应，基本表现为非酒精性脂肪肝，甚至器官损伤[16]，据统计，大概50%的糖尿病患者会发生脂肪肝，特别是40～50岁的糖尿病人群更甚。而桑黄多糖可以从调节机体内关键酶的活性和清除机体过剩自由基或降低氧化应激2条途径来发挥降血糖作用。但也有研究发现[17]，桑黄可以通过促进胰岛B细胞分泌胰岛素，降低胰岛素抵抗以及提升肝脏和肌肉对葡萄糖利用，来降低机体血糖值[18]，具体机制可能是：1) 提升参与胰岛素降糖作用的过氧化物酶增殖激活受体-γ(PPAR-γ)的表达量，降低机体的胰岛素抵抗作用[19]，或者显著激活过氧化物酶增殖激活受体-γ(PPAR-γ)的表达[20]；2) 促进血糖转化为肝糖原增强肌肉对糖的利用而降低空腹血糖水平从而起到降血糖的效果，或者通过降低丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性从而提升肝脏的功能来降血糖[21]。赵蕊针对糖尿病肾病的研究发现枸杞多糖能够上调II型糖尿病小鼠肾脏组织中PPAR-γ蛋白含量的表达，从而起到保护肾脏的作用[22]，从以上一系列不同研究中可以看出,桑黄多糖可以通过包括调节糖代谢关键酶的活性，增强机体抗氧化能力加强相关基因的表达提升相关组织中蛋白表达等多条途径来实现降低体内血糖同时保护脏器组织的目的。

试验结果表明:桑黄多糖可以缓解链脲佐菌素(STZ)造模的Ⅰ型糖尿病小鼠的症状，具体表现为,恢复期体重增长同时减少其摄食及饮水量缓解“三多一少”的症状，一定程度上缓和糖尿病小鼠血糖增高的趋势，且一定剂量的桑黄多糖可以显著降低糖尿病小鼠血糖值，同时提升糖尿病小鼠的耐糖性，而由脏器指数的测量可知桑黄多糖对肝脏糖代谢、脂肪代谢及肾脏功能有改善作用。综合而言，桑黄多糖显示出了针对I型糖尿病的辅助治疗能力，为天然提取物在降血糖治疗糖尿病的利用提供了理论依据，同时揭示了桑黄在降糖护肝保肾功能性食品的广阔应用前景。

[1] 戴玉成,崔宝凯.药用真菌桑黄种类研究[J].北京林业大学学报,2014,36(5):1-6.

[2] 史帧婷,包海鹰.桑黄类真菌有效成分及功效研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2016,22(22):197-202.

[3] 侯清涛,李芸,李舍予,等.全球糖尿病疾病负担现状[J].中国糖尿病杂志,2016,24(1):92-96.

[4] Guariguata L, Nolan T, Beagley J, et al. IDF(International Diabetes Federation) Diabetes Atlas, the 6 th Edition. International Diabetes Federation, 2013.

[5] 张雪丹.桑黄菌丝提取物及壳寡糖降血糖活性的研究[D].武汉:华中农业大学,2015:1-8.

[6] Peter G,Melanie-Jayne R.Howes,Sarah E.Edwards.Medicinal plants used in the traditional management of diabetes and its sequelae in Central America:A review[J].Journal of Ethnopharmacology,2016(184):58-71.

[7] 廖冬冬,林文庭.植物多糖降血糖作用机制的研究进展[J].海峡预防医学杂志,2012,18(2):26-28.

[8] 王斯慧,黄琬凌,王莹莹,等.辅助降血糖苦荞保健饮料的研制[J].食品工业,2012(2):63-65.

[9] 乔煦玮,吴玥霖,曾凡骏.辅助降血糖保健食品的研制[J].食品工业,2011(1):85-87.

[10] 武芸,丁莉,赵黎明.西洋菜中多糖提取工艺研究[J].湖北民族学院学报(自然科学版),2015,33(1):91-94.

[11] Jiang Shuang,Ren Dayong,Li Jianrui,et al.Effect of compound K on hyoerglycemia and insulin resistance in rats with type 2 diabetes mellitus[J]. Firoterapia,2014(95):56-58.

[12] Seo Yunsoo,Shon Miyae,Kong Ryong,et al.Black ginseng extract exerts anti-hyperglycemia effect via modulation of glucose metabolism in liver and muscle[J].Journal of Ethnopharmacology,2016(190):231-240.

[13] Megan E,Katie B,Riesa L,et al.Evaluation of US Veterans Nutrition Education for Diabetes Prevention[J].Journal of Nutrition Education and Behavior,2016,48(8):538-542.

[14] 于波.2型糖尿病治疗的首选药物-二甲双胍[J].赤峰学院学报(自然科学版),2015,31(2):94-95.

[15] 石永芳.黄芪多糖对Ⅱ-型糖尿病小鼠血糖的影响[J].安徽农业科学,2015,43(29):29-30,37.

[16] Evelyn S,Bo R J,Jeong D H,et al.Black ginseng extract ameliorates hypercholesterolemia in rats[J].J Ginseng Res,2016(40):160-168.

[17] 王华林,温万芳.桑黄的药用价值研究进展[J].时珍国医国药.2015,26(11):2747-2750.

[18] Chen H,Tian T,Miao H,et al.Traditional uses,fermentation,phytochemistry and pharmacology of Phellinus linteus:A review[J].Fitoterapia,2016(113):6-26.

[19] Ajith T A,Janardhanan K K.Antimutagenic effect of Phellinus rimosus (Berk) Pilat against chemical induced mutations of histidine dependent salmonella typhimurium strains[J]. Food Chem Toxicol,2011,49(10):2676-2680.

[20] Cho E J,Hwang H J,Kim S W,et al.Hypoglycemic effects of exopolysaccharides produced by mycelial cultures of two different mushrooms Tremella fuciformis and Phellinus bawmic in ob/ob mice[J].Appl Microbiol Biot.2007,75(6):1257-1265.

[21] Lee J J,Kim D H,Kim D G,et al.Phellinus baumii extractinfluences pathogenesis of Brucella abortus in phagocyte by disrupting the phagocytic and intracellular trafficking pathway[J].J Appl Microbiol. 2013,114(2):329-338.

[22] 赵蕊,王春仁,黄玉兰,等.枸杞多糖改善糖尿病肾病作用的研究[J].黑龙江八一农垦大学学报,2017,29(1):89-93.

EffectofPhellinusigniariuspolysaccharideontypeⅠdiabetesmicemodel

SHI Dejun1,2， CUI Qingmei2， QI Xin2， CUI Chengbi1,2*， CHEN Zhaoshuang3*

(1.KeyLaboratoryofNaturalResourceofChangbaiMountainandFunctionalMolecular,MinistryofEducation,YanbianUniversity,YanjiJilin133002,China;2.JilinKoreanFoodIndustry,PublicR&DCenter,YanjiJilin133002,China;3.ChangbaiMountainScienceResearchInstitute,AntuJilin133600,China)

In order to determine the effect ofPhellinusigniariuspolysaccharide on type 1 diabetes mellitus (DM) mice model,P.igniariusfrom Poplar was obtained andP.igniariuspolysaccharide was extract by water, then Kunming (KM) mice were made as type 1 DM animal model by streptozotocin at a single dose of 100 mg/kg·BW, which were used to investigate the effect ofP.igniariuspolysaccharide of different doses (Low dose 20 mg/kg·BW, middle dose 40 mg/kg·BW, high dose 80 mg/kg·BW) . The results showed that the symptoms of type 1 DM mice had improved. Specifically, at the 3rd week of the experiment, the mean weight of mice in high dose group was 36.17 g, significantly higher than that of the DM group (P<0.05), and increased by 17.89%, which was close to that in control group and water intake was also declined; and fast blood glucose level of high dose group was significantly lower than that of the DM group (P<0.05), and decreased by 23.96%; meanwhile the OGTT in high dose group was significantly higher than that of the DM group(P<0.05), and increased by 31.02%. As for the organ coefficient, the liver index of high dose group was significantly higher than that of the DM group(P<0.05), which increased by 55.03 %, and there was no significant difference between the three dose groups in kidney index but they were all significantly higher than the DM group (P<0.05). All the results above taken together showed that the high dose ofP.igniariuspolysaccharide extract contributes so much to the improvement of symptoms in type 1 DM mice.

Phellinusigniarius;Phellinusigniariuspolysaccharide; type Ⅰ diabetes; hypoglycemic; organ coefficient

2017-07-09

中央财政厅林业科技推广示范项目[吉推(2014)11号]

史得君(1992—)，男，河北张家口人，在读硕士，研究方向为农产品质量安全性评价。崔承弼，陈兆双为共同通

信作者，E-mail:danielloueyd@qq.com

1004-7999(2017)03-0033-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.006

R285.5

A