苯酚-硫酸法测定榛花多糖含量分析条件的优化

吴 鑫， 黄杰涛， 张莲姬

(延边大学，吉林 延吉 133000)

苯酚-硫酸法测定榛花多糖含量分析条件的优化

吴 鑫， 黄杰涛， 张莲姬*

(延边大学，吉林 延吉 133000)

以葡萄糖为标准品，通过单因素和L9(34)正交试验，优化苯酚-硫酸法测定榛花多糖含量的显色条件，并对该法的精密度、加标回收率等进行研究。结果表明：最佳显色条件是浓硫酸5.0 mL， 5%苯酚0.6 mL，显色温度30 ℃，显色时间40 min。在此条件下，平均回收率为99.34%，相对标准偏差(RSD)0.35%。优化后的苯酚-硫酸法是测定榛花多糖含量的一种稳定性好、回收率高的简便方法。

榛花；多糖；苯酚-硫酸法

榛是一种被子植物，分布在我国22个省(区)，生长迅速，资源很丰富。榛花为榛树的雄花，具有消炎、消肿及止痛作用，可用于皮肤炎症、冻伤等，是一味民间沿用历史悠久的药用植物[1-2]。国内外对榛花的研究始于2001年，南征等首次报道了榛花具有解毒、降血糖作用[3]。在此基础上蔡英兰等进行了更系统的榛花对四氧嘧啶性糖尿病小鼠的降糖作用的实验研究，并初步探讨了其降糖机理[4-5]。其后的研究报道表明,榛花总黄酮、榛花有机溶剂提取物和水提取物都具有很好的抗氧化能力[6-13]。但目前为止关于榛花多糖的研究尚未见报道。

多糖含量对于评价一种多糖产品具有重要的意义，是其进一步开发应用的重要前提，因此,对多糖含量测定的准确性有了更高的要求，多糖含量测定方法的研究具有重要的意义[14-18]。目前检测多糖含量的方法主要有高效液相色谱法和比色法，前者因高纯度的多糖对照品难以获得等因素的制约而较少使用，而后者作为测量多糖的经典方法，不需要大型仪器，操作简单易行，结果准确可靠，在多糖的研究中得到了广泛的应用。苯酚-硫酸比色法是测定多糖含量的传统方法而被广泛应用[19-23]。其测定原理是在浓硫酸的作用下将多糖水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，该物质与苯酚反应生成橙黄色化合物，在波长490 nm附近处和一定浓度范围内，其吸光度与糖浓度呈线性关系。但苯酚-硫酸法存在一定的波动性，不同的含多糖类物质测定条件均有所不同，如果只参考已有文献的测定条件来确定具体的试验参数将可能造成较大的误差。为此，本研究在选择浓硫酸用量、苯酚用量、显色时间和显色温度进行单因素试验的基础上，进一步通过正交试验优化苯酚-硫酸法测定榛花多糖含量的显色条件，并对该方法的稳定性、精密度、回收率等进行研究，得出榛花多糖含量的最佳测定条件。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

1) 材料：榛花采集于吉林省长白山，晒干后粉碎，过60目筛，备用。

2) 试剂：无水乙醇、石油醚、浓硫酸、三氯乙酸、苯酚、葡萄糖均为分析纯。

1.2仪器与设备

HH-2数显恒温水浴锅(江苏省金坛市科析仪器有限公司)；U-3010紫外分光光度计(日本日立公司)；8-20 型多管离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.3方法

1.3.1 溶液的配制

1) 榛花粗多糖供试液的配制：将一定量干燥的榛花粉，置于索氏提取器装置中，分别以无水乙醚和无水乙醇处理至回流液的颜色接近无色，挥干溶剂后置于60 ℃烘箱中烘干。准确称取经处理的榛花粉1 000 g，加入30 mL蒸馏水，在80 ℃水浴条件下浸提2次，每次2 h，3 500 r/min离心20 min，取上清液用去离子水定容至1 000 mL，即得榛花粗多糖供试液。

2) 葡萄糖标准溶液的配制：精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.100 0 g，用蒸馏水定容至100 mL，配制成1 mg/mL的葡萄糖标准储备液。准确移取葡萄糖标准储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，即得浓度为20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖标准溶液。

3) 5%苯酚溶液的配制:取苯酚75.0 g，加0.1 g铝片和0.05 g 无水碳酸钠，蒸馏收集182 ℃馏分，称取此馏分25.0 g 置于500 mL的容量瓶中，加蒸馏水溶解定容，摇匀后置于棕色瓶中，放入冰箱避光保存，备用。

1.3.2 单因素试验

分别考察浓硫酸用量、苯酚用量、显色温度和显色时间对490 nm处[24]榛花多糖显色后吸光度的影响，平行做3次。

1.3.3 L9(34)正文试验

在上述单因素试验结果基础上以吸光度为评价指标，进行L9(34)正交试验，每组作3个平行试验，取平均值，得出苯酚-硫酸法测定榛花多糖含量的最佳显色条件。因素水平设计见表1。

表1 因素水平表

1.3.4 葡萄糖标准曲线的绘制

分别吸取1 mL 20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖标准储备液，取1 mL去离子水为空白对照，按1.3.3确定的最佳显色条件，于490 nm处测吸光度，以葡萄糖浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程。

1.3.5 精密度试验

吸取榛花多糖供试液1.0 mL，按1.3.3确定的最佳显色条件，于490 nm处测吸光度，平行测定5次，计算相对标准偏差，并分析其重现性。

1.3.6 稳定性试验

吸取榛花多糖供试液1.0 mL，按1.3.3确定的最佳显色条件，于490 nm处每隔一定时间测吸光度。

1.3.7 加标回收率试验

分别吸取榛花多糖供试液1.0 mL 3份于50 mL锥形瓶中，按1.3.3确定的最佳测定条件，于490 nm处测吸光度。另取3份榛花多糖溶液1.0 mL于50 mL锥形瓶中，分别加入1.0 mL浓度不同的葡萄糖标准溶液，按1.3.3确定的最佳显色条件，于490 nm处测吸光度，并计算加标回收率。

回收率=(加标试样测定值-试样测定值)/加标量×100%

2 结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1 浓硫酸用量对吸光度的影响

由图1可知，随着浓硫酸加入量的增加，溶液的吸光度呈先升高后减少的趋势，当浓硫酸的加入量为5.0 mL时，吸光度值达到最高值，继续增加浓硫酸用量会使吸光度值下降，因此，选择5.0 mL浓硫酸为最佳用量。

图1 不同浓硫酸用量的吸光度比较

2.1.2 苯酚用量对吸光度的影响

由图2可知，5%苯酚加入量为0.6 mL时，吸光度达到最高值，继续增大苯酚用量，吸光度值有明显的下降，因此,选择0.6 mL为最佳5%苯酚用量。

图2 不同苯酚用量的吸光度比较

2.1.3 显色时间对吸光度的影响

由图3可知，随着显色时间从20增加到30 min时,吸光度也增加，显色时间为30 min时吸光度最大，再增加显色时间时吸光度又缓慢减少，其原因可能是时间过长，多糖结构部分受到破坏，从而导致吸光度的降低[25]。因此,选择最佳的显色时间为30 min。

图3 不同显色时间的吸光度比较

2.1.4 显色温度对吸光度的影响

由图4可知，不同显色温度对吸光度值有明显的影响，当显色温度为30 ℃时，吸光度达到最高值，其后吸光度下降，超过50 ℃后下降更明显，因此,选择显色温度为30 ℃。

图4 不同显色温度的吸光度比较

2.2正交试验

根据单因素试验结果，设计浓硫酸用量、苯酚用量、显色时间、显色温度水平表(表1)，采用L9(34)正交试验优化苯酚-硫酸法测定榛花多糖含量的显色条件。正交试验结果见表2。

表2 L9(34)正交试验结果

由表2可知，硫酸用量对吸光度的影响最大，是影响测定多糖含量的最主要因素；各因素对吸光度的影响大小顺序是：硫酸用量>苯酚用量>显色温度>显色时间；且测定榛花多糖含量的最佳因素组合是A2B2C3D2，而试验测定结果中，吸光度最大的组合为A2B2C3D1，因此,对这2组进行比较试验，其结果见表3。

表3 试验组的吸光度比较结果

由表3可知，A2B2C3D2组合优于A2B2C3D1, 所以最佳测定条件为A2B2C3D2, 即浓硫酸5 mL，5%苯酚0.6 mL，显色时间40 min，显色温度30 ℃。

2.3标准曲线的绘制

以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线(图5)，葡萄糖为20 ～120 μg/mL时,其浓度与吸光度线性关系良好，线性回归方程为Y =0.010 49 x-0.055 8，相关系数R2=0.999 6。

图5 葡萄糖标准曲线

2.4精密度试验

吸取榛花粗多糖供试液1 mL，在最优测定条件下平行测定5次，计算RSD值为0.68%，表明重现性良好。

2.5稳定性试验

由表4可知，榛花多糖样品液在120 min内稳定性良好，随着时间的增加，吸光度值略有下降，尤其在前60 min内吸光度值由最初0. 620只降至0.609,120 min时降至0.597，相对平均偏差RSD为0.50%。

表4 稳定性测定结果

2.6加标回收率试验

由表5可知，该实验方法的平均回收率为99.34%，RSD为0.35%，表明该测定方法准确率高。

表5 加标回收率试验结果

3 结论

通过单因素试验和L9(34)正交试验分析结果可以看出，在苯酚-硫酸法测定榛花多糖过程中，各因素的影响顺序为硫酸用量>苯酚用量>显色温度>显色时间。苯酚-硫酸法中显色的最佳条件为浓硫酸5.0 mL，5%苯酚0.6 mL，显色温度30 ℃，显色时间40 min。在最优条件下测定的平均回收率为99.34%，RSD为0.35%，显色液在2 h内稳定性良好，表明该方法稳定性和重现性较好，快速简便，结果准确，适用于榛花多糖含量的定量测定。

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Optimizationofanalyticalconditionsforthedeterminationofpolysaccharidecontentinhazelnutbyphenolsulfuricacidmethod

WU Xin， HUANG Jietao, ZHANG Lianji

(YanbianUniversity,YanjiJilin133000,China)

With glucose as standard, through the single factor and L9(34) orthogonal experiment, the phenol sulfuric acid method to determine the polysaccharide content of Hazel's flower color conditions was optimized, and the precision of the method and its recovery rate were studied. The results showed that the best color condition was 490nm, the concentration of concentrated sulfuric acid was 5.0 mL, the content of phenol was 5% 0.6 mL, the color temperature was 30 ℃, and the color time was 40 min. Under these conditions, the average recovery was 99.34%, and the relative standard deviation (RSD) was about 0.35%. The phenol-sulfuric acid method optimized was a simple method to detect Hazel's flower polysaccharide content with high stability and high recovery rate.

hazelnut flower; polysaccharide; phenol-sulfuric acid method

2017-01-11

延边大学2016年大学生创新创业训练计划项目(ydbksky2016102)

吴鑫(1995—)，男，山西运城人，在读学士，研究方向为天然产物的提取。张莲姬为通信作者，

E-mail：736313515@qq.com

1004-7999(2017)03-0044-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.008

R284

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