纤维素、半纤维素分解菌MYB3和YB1菌株的生物学特性研究

白 冰， 李光春

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

纤维素、半纤维素分解菌MYB3和YB1菌株的生物学特性研究

白 冰， 李光春*

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

对纤维素、半纤维素分解菌MYB3和YB1菌株在不同温度和pH值条件下的存活性、酶活性及对秸秆分解特性进行初步研究。结果表明：MYB3菌株存活的最适条件为35 ℃，pH值8时；YB1菌株为30 ℃，pH值9。2种菌在发酵中生成的纤维素酶活性最高，分别达到19.28 U/mL(MYB3-玉米秸秆-3 d)和19.5 U/mL(YB1-稻草-3 d)；半纤维素酶最高分别达到6.66 U/mL(MYB3-玉米秸秆-2 d)和17.17 U/mL(YB1-稻草-4 d)；淀粉酶活性最高分别达到9.84 U/mL(MYB3-玉米秸秆-3 d)和10.65 U/mL(YB1-稻草-5 d)。MYB3菌株适合玉米秸秆发酵，纤维素、半纤维素分解率(5 d)分别为39.03%和14.67%；YB1菌株适合稻草发酵，纤维素、半纤维素分解率(5 d)分别为31.53%和37.44%。

玉米秸秆；稻草；纤维素分解菌；半纤维素分解菌；分解特性

我国是农业大国，秸秆资源十分丰富，每年的秸秆资源量占生物质能源的一半，作为可直接利用的自然资源，年产量约占农作物产量的一半[1]。虽然秸秆的产生数量巨大，但是利用率较低，目前我国秸秆资源的处理方式完全处于高消耗、高污染、低利用的状态。秸秆资源除了一少部分被应用于沼气发酵、养殖蘑菇等外[2]，全国每年约有60%以上的秸秆被焚烧或是废弃[3]，这种处理方式很容易引发火灾，产生的烟雾等还影响交通安全，污染大气环境，甚至破坏生态平衡，更是严重浪费了宝贵的生物资源。吉林省在全省范围内，禁止露天焚烧农作物秸秆，因此更加重视秸秆的合理化处理和资源利用。秸秆处理是社会和环境问题，更是政府焦虑、社会关心、舆论关注的热点和难点所在[4]。秸秆中的纤维素占植物干重的35%～50%，全球每年可产生纤维素类干物质达1012t以上[5-6]，其中秸秆饲料是一种很常见的秸秆利用方式。但是秸秆中的纤维素、木质素和半纤维素等均不易被家畜消化吸收，且适口性较差[7]，因此家畜利用秸秆的营养转化率较低。为了提高饲料转化率，开始研究利用微生物对秸秆进行发酵后饲喂动物。秸秆被微生物发酵处理后，发酵产物富含粗糖、粗蛋白及其它微量元素，动物适口性较好，易于被家畜、家禽消化，可有效缓解人畜争粮和资源再利用的问题。同时，促进畜牧业的发展，具有较显著的经济效益和社会效益[8-10]。目前已有不少研究纤维素分解微生物的报道[11-14]，其中细菌是分解纤维素微生物中数量最多，分布最广的一类。细菌具有生长快、生物活性广泛、结构简单、适应性强等特点[15]。本文主要研究纤维素、半纤维素分解菌的生物学和分解秸秆特性，为微生物秸秆发酵饲料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

供试菌MYB3菌株和YB1菌株是一种纤维素、半纤维素分解菌[16-17]，由延边大学农学院土壤环境技术研究所提供。2种菌经16S rDNA测序分析(上海美吉生物医药科技有限公司北京分公司)分别为Bacillussp.和Enterobactersp.细菌。

玉米秸秆和稻草均采集自延边朝鲜族自治州延吉市延边大学校外的农田。玉米秸秆的水分含量为7.32%，纤维素含量为34.17%，半纤维素含量为35.04%；稻草的水分含量为6.08%，纤维素含量为30.42%，半纤维素含量为34.91%。

用于分解实验的富集培养基组成成分为:K2HPO42.0 g，(NH4)2SO41.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CoCl22.0 mg，CaCl20.3 g，FeSO4·7H2O 5.0 mg, ZnSO41.7 mg，MnSO4·H2O 1.6 mg，溶于1 L蒸馏水中。接种菌液培养用LB培养基: 酵母膏 5.0 g,蛋白胨 10.0 g，琼脂 15.0 g，NaCl 10.0 g，溶于1 L蒸馏水中。

1.2MYB3菌株和YB1菌株在不同温度和pH值条件下的存活数

取0.1 mL 1.48 × 105(cfu/mL)待测菌液接种到0.9 mL灭菌蒸馏水的离心管中。重复上述流程，系列稀释到108倍菌液。吸取不同稀释倍数的0.1 mL菌液，注入到LB平板上涂布后，把培养皿分别在20、30、35、40和45 ℃的培养箱中培养24 h，采用CFU平板计数法检测菌落数，评价不同温度下的生存特性。

为评价不同pH值条件下菌的存活性，首先准备好LB培养基中培养1 d的接种液(30 ℃)，在配好的pH值2～12的10 mL磷酸盐缓冲溶液中接种1%体积比的菌液,在30 ℃培养4 h后用CFU平板计数法检测菌落数。

1.3分解酶活性的测定

为检测2种菌分解秸秆过程中各种分解酶的活性变化，利用装入200 mL富集培养基的三角瓶中加入2.5%重量比的玉米秸秆或稻草，接种1%体积比的菌，在30 ℃，100 r/min恒温摇床中培养，每隔1 d取样，利用刘小杰[18]、彭强[19]、宋宏[20]的实验方法分析纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶的活性。

1.4纤维素、半纤维素含量的测定

含有200 mL富集培养基的三角瓶中加入2.5%重量比的玉米秸秆或稻草，接种1%体积比的菌，在30 ℃，100 r/min恒温摇床中培养,分别在培养3，5 d 时，取样分析纤维素、半纤维素含量。利用王金主等[21]的硫酸与重铬酸钾氧化法测定秸秆中纤维素含量，准确称取80 ℃烘干4 h的粉碎秸秆样品0.10 g进行预处理，后加入硫酸与重铬酸钾将其氧化，再加入碘化钾溶液，最后用0.2 mol/L的硫代硫酸钠溶液滴定，待溶液刚好显蓝色且半分钟不变色时停止滴定，记录消耗硫代硫酸钠体积。另外做一组空白对照。

利用盐酸水解法[21]测量秸秆中的半纤维素含量，并在最后用DNS显色法，在OD540 nm处测吸光度，对照葡萄糖标准曲线得出还原糖含量，然后再乘以0.9即得半纤维素含量，测定还原糖的含量，最终计算含量。

2 结果与分析

2.1分解菌的生物学特性

2.1.1 不同温度下2种菌的存活特性

MYB3菌株在20 ℃下处理的活菌数为2.23 × 106cfu/mL，在35 ℃培养达到最高活菌数6.3 × 106cfu/mL,随着温度继续升高，菌体的活菌数逐渐下降，在40 ℃处理的活菌数为5.3 × 106cfu/mL，在45 ℃下活菌数仅为4.1×106cfu/mL(图1)。

图1 不同温度下MYB3菌株的存活数

YB1菌株在20 ℃下处理的活菌数为3.08 × 109cfu/mL，在30 ℃下达到最高活菌数为4.62 × 109cfu/mL，随着温度升高，YB1菌株的活菌数逐渐下降，在45 ℃时，处理的活菌数为2.75 × 109cfu/mL(图2)。

图2 不同温度下YB1菌株的存活数

2.1.2 不同pH值条件下MYB3菌株和YB1菌株的存活特性

在pH值为2时，无菌生存，随着pH值的增加，MYB3菌株的活菌数有明显增加的趋势，在pH值为8时，活菌数达到了高峰，为25.1 × 103cfu/mL，之后随着pH值的升高活菌数开始下降，在pH值为12时，活菌数仅为2.43 × 103cfu/mL (图3)。

图3 不同pH条件下MYB3菌株的存活数

YB1菌株在不同pH值条件下生存特性不同于MYB3菌株。在pH值为5时，活菌数为0.006 × 109cfu/mL，随着pH值的增加，YB1菌株的存活数有增加趋势，pH值为8时，急剧增加存活数，在pH值为9时存活数达到了高峰，为314 × 109cfu/mL，之后随着pH值的升高，存活数开始下降，在pH值为12时，活菌数仅为0.163 × 109cfu/mL(图4)。

图4 不同pH条件下YB1菌株的存活数

2.2MYB3菌株和YB1菌株对发酵中纤维素酶、半纤维素酶以及淀粉酶活性的影响

2.2.1 MYB3菌株对秸秆发酵中酶活性变化的影响

MYB3菌株分解玉米秸秆过程中，酶活性总体呈倒U型曲线状态(图5)。培养1 d后纤维素分解酶的酶活性达到4.67 U/mL，之后逐步上升，在第3 天达到最高，酶活性为19.28 U/mL，比1 d后的纤维素酶活性高4.1倍。之后，酶活性逐步下降，在第5天时酶活性下降到5.82 U/mL。半纤维素酶也表现出与纤维素酶类似的变化趋势，酶活性呈倒U型曲线状态，但是与纤维素酶活性相比变化幅度不大。1 d后半纤维素酶的酶活性值达到3.95 U/mL，之后逐步升高，在第3天达到顶峰，酶活性为5.84 U/mL，比1 d后高1.5倍。之后，酶活性逐步下降，在第5天酶活性仅为4.04 U/mL。淀粉酶的活性变化规律表现出与纤维素酶类似的趋势，但淀粉酶的活性一直处于较低水平，1 d后淀粉酶的酶活性值达到4.1 U/mL，之后逐渐升高，在第2天达到最高酶活性6.67 U/mL，仅增加1.6倍。之后逐步下降，第5天下降到4.65 U/mL。

图5 MYB3菌株玉米秸秆发酵后分解酶的活性变化

MYB3菌株分解稻草过程中，酶活性呈倒U型曲线状态(图6)。培养1 d后纤维素分解酶活性为2.67 U/mL，之后逐步上升，在第3天达到最高，酶活性为5.63 U/mL ，比1 d后的纤维素酶活性高2.1倍。之后，酶活性逐步下降，第5天酶活性下降

到1.90 U/mL。半纤维素酶活性是1 d后达到5.56 U/mL，之后逐步上升，在第2天达到最高，酶活性为6.41 U/mL，比1 d后高1.2倍。之后，半纤维素酶活性逐步下降，第5天时降到4.81 U/mL。不同于纤维素酶和淀粉酶，半纤维素活性一直处于比较高的水平。淀粉酶的活性变化与纤维素酶活性变化基本相同，培养1 d后培养液中淀粉酶活性为3.35 U/mL，之后逐渐上升，在第3天达到最高，酶活性为5.41 U/mL，比1 d后高1.6倍。之后逐步下降，第5天下降到2.88 U/mL。

图6 MYB3菌株稻草发酵后分解酶的活性变化

2.2.2 YB1菌株对秸秆发酵过程中酶活性变化的影响

YB1菌株分解玉米秸秆过程中，纤维素酶和半纤维素酶活性变化曲线呈倒U型(图7)。培养1 d后，纤维素分解酶活性为0.92 U/mL，之后逐步升高，第3天达到最高，酶活性为7.09 U/mL，比1 d后高7.7倍。之后，酶活性逐步下降，第5天酶活性下降到1.04 U/mL。半纤维素酶活性是培养1 d后达到4.06 U/mL，第3天酶活性急剧上升，达到最高峰，酶活性为10.58 U/mL，比1 d后高2.6倍。之后逐步下降，第5天酶活性下降到5.41 U/mL。玉米秸秆发酵液中淀粉酶的活性一开始处于高水平，培养1 d后淀粉酶的酶活性为3.18 U/mL，之后酶活性一直处于下降趋势，第5天超出了检测限，视为0。

图7 YB1菌株玉米秸秆发酵后分解酶的活性变化

YB1菌株分解稻草过程中，纤维素酶和半纤维素酶活性变化曲线呈倒U型(图8)。培养1 d后纤维素酶活性达到3.59 U/mL，之后逐步上升，第3天酶活性急剧上升，达到最高值19.5 U/mL，比1 d后高9.4倍。之后逐步下降，第5天酶活性下降为3.92 U/mL。半纤维素酶是1 d后酶活性达到3.23 U/mL，之后逐步升高，在第4天酶活性达到最高17.17 U/mL，比1 d后高5.3倍。之后逐步下降，第5天酶活性下降到4.30 U/mL。淀粉酶活性是一直处于上升状态，从培养1 d时的2.03 U/mL到第5天的10.65 U/mL，上升了5.2倍。

图8 YB1菌株稻草发酵后分解酶的活性变化

MYB3菌株接种于玉米秸秆发酵后，生成的纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶活性均高于稻草发酵。说明MYB3菌株对玉米秸秆中的纤维素、半纤维素和淀粉分解能力均高于稻草。利用YB1菌株进行玉米秸秆和稻草发酵，在玉米秸秆发酵中半纤维素酶活性高于纤维素酶活性，稻草发酵中生成的纤维素酶，半纤维素酶和淀粉酶活性均为最高，说明YB1菌株对稻草的分解能力高于玉米秸秆。

2.3纤维素、半纤维素分解特性

利用MYB3菌株发酵玉米秸秆和稻草时，第5天的纤维素分解率分别是39.03%和15.52%，利用YB1菌株进行发酵时，第5天纤维素分解率是21.9%和31.53%(图9)。说明MYB3菌株更适合于玉米秸秆发酵，而YB1菌株对稻草的纤维素分解能力更大。结合上述酶活性变化，分析出2种菌对玉米秸秆和稻草中纤维素分解率的变化与发酵过程中生成的纤维素酶活性变化规律相一致。

图9 不同处理3 d、5 d 后的纤维素分解率

半纤维素分解规律与纤维素分解不同，由图10可知，发酵5 d后接种MYB3菌株的玉米秸秆和稻草中的半纤维素分解率分别为14.67%和17.61%；接种YB1菌株的玉米秸秆和稻草中半纤维素分解率为26.37%和37.44%。总的来说，YB1菌株对秸秆中半纤维素分解能力高于MYB3菌株。这与发酵过程中产生的半纤维素酶活性变化规律相一致。

图10 不同处理组3和5 d 后的半纤维素分解率

3 讨论与结论

不同的温度和pH值条件对微生物的生存起到重要的作用。该试验中，MYB3菌株在20 ～ 45 ℃范围内均可生存，其最适生存温度为35 ℃；YB1菌株在20～45 ℃时也均可生存，其最适合生存温度为30 ℃。MYB3菌株在pH值为3～12的范围内均可生存，最适生存酸碱度为pH值8时；YB1菌株在pH值为5～12范围内均可生存， 最适生存酸碱度为pH值为9。根据不同温度和pH值条件下菌的生存能力分析，MYB3菌株更适合在动物肠道内环境下生存。

本文通过培养液中的纤维素、半纤维素和淀粉酶活性变化来分析MYB3菌株和YB1菌株对玉米秸秆和稻草的发酵效果。一般情况下具有生成纤维素酶的微生物对淀粉也有较好的降解作用。根据淀粉酶的活性变化可知，利用MYB3菌株进行秸秆发酵过程中淀粉酶活性在发酵前期(1～2 d)较高，之后呈下降趋势，这与宋宏[20]所研究的结果相一致。说明淀粉类的非纤维素物质在玉米秸秆发酵过程中最先被分解和利用，其代谢产物成为微生物在前期生长所需的能量物质。YB1菌株秸秆发酵中，淀粉酶活性的变化与MYB3菌株的变化不同，在发酵玉米秸秆中，发酵1 d时最高，之后逐步下降，在发酵稻草中，培养1 d时最低，之后逐步上升。这可能是2种菌的秸秆分解机制不同，玉米秸秆和稻草中淀粉的含量不同产生的。

任佐华[22]通过将筛选出的菌与秸秆培养，得出半纤维素分解酶最高值为11.03 U/mL，周亚飞[23]通过将筛选的菌种与秸秆培养，得出的纤维素酶和淀粉酶活性最高值为2.63和6.17 U/mL，王小娟等[24]筛选出的纤维素分解菌纤维素酶活性最高值为4.35 U/mL。本试验得出的纤维素酶活性最高值分别为19.28 U/mL(MYB3-玉米秸秆-3 d)和19.5 U/mL(YB1-稻草-3 d)，而半纤维素酶活性最高值为17.17 U/mL(YB1-稻草-4 d)，均高于王小娟等试验的结果，说明该试验中可生成高效分解酶。MYB3菌株在玉米秸秆发酵中对纤维素分解起到重要作用；YB1菌株在玉米秸秆和稻草发酵中对半纤维素分解起到重要作用。纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶活性的变化与李伟平、潘迎捷等的[25-26]营养物质对胞外酶活性的影响研究中的结果相一致。MYB3菌株和YB1菌株均可生成高效纤维素、半纤维素和淀粉酶。玉米秸秆发酵中，呈倒U型曲线变化趋势。

秸秆发酵试验中，结合3种分解酶活性变化，分析了纤维素和半纤维素含量。MYB3菌株和YB1菌株对秸秆发酵，纤维素分解率最高可达到39.03%(MYB3-5 d-玉米秸秆)，半纤维素分解率可达到37.44%(YB1-5 d-稻草)。一些相关报道，如李静等[27]复合菌系的纤维素分解率为31.8%；李轶等[28]不同的预处理工艺试验中半纤维素分解率32.98%。对比下，MYB3菌株和YB1菌株均表现出高效分解纤维素、半纤维素的能力，在较广范围的温度，pH值条件下可生存。MYB3菌株适合玉米秸秆发酵，YB1菌株适合稻草发酵，且MYB3菌株纤维素分解能力较好，YB1菌株半纤维素分解能力相对于MYB3菌株更优秀。MYB3菌株可作为秸秆发酵饲料用候补菌剂，值得进一步研究。

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StudyonthebiologicalcharacteristicsoftwokindsofcellulolyticandhemicellulolyticmicrobesMYB3stainandYB1stain

BAI Bing， LI Guangchun*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002，China)

The biological characteristics of the cellulolytic and hemicellulolytic microbes MYB3 strain and YB1 stain were studied in this research, including the decomposition characteristics for the straw and the survivability in different temperature and pH value. The results showed that the optimum survival conditions is 35 ℃, pH 8 for the MYB3 stain, and 30 ℃ and pH 9 for the YB1 strain. The highest cellulase activity of the two kinds of bacteria was acquired under the fermentation condition, and the level was 19.28 U/mL (MYB3 corn stover 3 d) and 19.5 U/mL (YB1 rice straw 3 d). The highest hemicellulase activity reached 6.66 (MYB3 corn stover 2 d), 17.17 U/mL (YB1 rice straw 4 d). The highest amylase activity reached 9.84 U/mL (MYB3 corn stover 3 d), 10.65 U/mL(YB1 rice straw 5 d). The MYB3 strain was suitable for corn stover fermentation, which the cellulose and hemicellulose decomposition rate (5 d) was 39.03% and 14.67%. The YB1 strain was suitable for rice straw fermentation, which the cellulose and hemicellulose decomposition rate (5 d) were 31.53% and 37.44%.

corn stover; rice straw; cellulolytic microbe; hemicellulolytic microbe; decomposition characteristics

2017-04-15

吉林省重点科技攻关项目(20150204068NY)。

白冰(1992—)，女，吉林辽源人，在读硕士，研究方向为农业环境与生物质资源综合利用。李光春为通信作者，

E-mail：gcli@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)03-0055-07

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.010

S154.2

A