玄参与烟草轮作对根际土壤养分、酶活性及微生物群落结构的影响

伍晓丽，潘 媛，赵 晓，谭 均，陈大霞

(1.重庆市中药研究院中药种植研究所，重庆 400065；2.中国中医科学院中药资源中心重庆分中心，重庆 400065；3.中药资源学重庆市重点实验室，重庆 400065；4.重庆市中药良种选育与评价工程技术研究中心，重庆 400065)

【研究意义】玄参(ScrophularianingpoensisHemsl.)为玄参科玄参属植物，以干燥根茎入药，具有凉血滋阴、泻火解毒的功效，主治骨蒸、痨咳、津伤便秘、温毒发斑、目赤、咽痛、臃肿等[1]。生产上发现，玄参会发生明显的连作障碍，连作的玄参烂根率、病害发生率、死苗率均高于非连作地块。造成连作障碍的因素很复杂，主要是土壤中微生物种群失调、理化性质改变、化感自毒物质积累及这三者之间的相互作用[2]。生产实践和大量研究表明，不同植物轮作是克服连作障碍的有效手段[3-7]。【前人研究进展】林孝培等发现，在厚朴林下轮作玄参、大黄，比对照增产玄参药材320 kg/667 m2[8]；黎妍妍等发现，万寿菊—烟草轮作可提高烟株根际土壤细菌群落多样性和丰富度，促使生防菌、功能菌、降解菌、根际促生菌比例上升，有利于改善土壤微生态环境、缓解连作障碍[9]。【本研究切入点】重庆武隆是玄参主要产区之一，同时也是烟草主要产区，二者的轮作，国内外尚无相关报道。研究玄参-烟草轮作，对克服玄参连作障碍，增加当地农民收入有积极意义。【拟解决的关键问题】设计玄参和烟草的不同轮作模式，观察其对土壤理化性质和微生物种群结构的影响，为生产上克服玄参连作障碍提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

试验用玄参、烟草均为重庆市武隆区大田生产用种。

试验地位于重庆市武隆区仙女山镇荆竹村。设烟草—玄参—玄参(A)、烟草—玄参—烟草(B)、烟草—玄参(C)三种轮作模式，每种模式3次重复，随机区组排列，共计9个小区。试验地概况和玄参栽培方法参考陈大霞等[10]。烟草苗5月1日移栽，行株距为110 cm×55 cm。每个小区面积36 m2。按照常规施肥，其中施纯氮为100 kg/hm2，氮、磷、钾重量比为1∶1∶3。

在最后一茬作物收获时收集根际土壤样本。采用“抖根法”，将植株根系从土壤中挖出并抖掉与根系松散结合的土体，然后采集与根系紧密结合的土壤，装自封袋，小区内按照五点法取样，五个样混合为一个样品。共计9个样品。用车载冰箱带回存于-80 ℃备用。

1.2 方法

1.2.1 土壤养分检测 有效钾：火焰光度法；有效磷：比色法；有效氮(水解性氮)：碱解扩散法；有机质：重铬酸钾法；pH：酸度计法[11]。

1.2.2 土壤酶活性检测 土壤过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶分别使用苏州科铭生物技术有限公司Solid-Catalase、Solid-Urease、Solid-Sucrase、S-AKP/ALP试剂盒检测，检测方法参照说明书。

1.2.3 土壤微生物检测 土壤真菌和细菌检测由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行，采用CTAB法提取土壤微生物基因组DNA。将纯化后的基因组DNA作为PCR模板进行扩增，扩增细菌16S rDNA的V4区。使用引物：515F，GTGCCAGCMGCCGCGGTAA；806R，GGACTACHVGGGTWTCTAAT。扩增条件：98 ℃预变性1 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环后，72 ℃延伸5 min；真菌扩增ITS1区域。使用引物：ITS5-1737F，GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG；ITS2-2043R，GCTGCGTTCTTCATCGATGC。扩增条件：98 ℃预变性1 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环后，72 ℃延伸5 min。

目的条带用Qiagen公司生产的QIA quick Gel Extraction Kit凝胶回收试剂盒切胶回收。测序平台为Illumina NovaSeq。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2007进行数据统计，SPSS 17.0进行数据分析。

2 结果与分析

通过高通量测序分析，从9个土壤样品中共检测到细菌79门176纲370目503科788属342种，共检测到真菌15门50纲120目265科470属594种。

2.1 不同轮作模式对根际土壤养分和酶活性的影响

不同轮作模式对土壤养分的影响不大，仅对pH有显著影响(P<0.05)，其中烟草—玄参—烟草的土壤pH显著低于烟草—玄参—玄参和烟草—玄参。可见，烟草和玄参轮作一次后，再种植玄参对pH没有显著影响，但如果再种植烟草会降低土壤pH。不同轮作模式对土壤蔗糖酶和碱性磷酸酶活性有极显著影响(P<0.01)，对过氧化氢酶和脲酶活性无显著影响。蔗糖酶活性烟草—玄参轮作最高，比烟草—玄参—玄参增加24.46%，比烟草—玄参—烟草增加173.99%。碱性磷酸酶活性还是烟草—玄参轮作最高，比烟草—玄参—玄参增加24.93%，比烟草—玄参—烟草增加124.38%(表1)。

2.2 不同轮作模式对根际土壤微生物的影响

2.2.1 不同轮作模式对根际土壤真菌和细菌α-多样性的影响 由表2可见，不同轮作模式对根际土壤真菌和细菌α-多样性没有显著影响。

2.2.2 根际土壤真菌和细菌种类比较 ①细菌。土壤中细菌的优势属是RB41、乳酸杆菌属 (Lactobacillussp.)、苔藓杆菌属(Bryobactersp.)等。属水平Terrimonassp.、Bryobactersp.、Ramlibactersp.等差异显著，如：Terrimonassp.A、C大约是B的2～3倍；亚硝化杆菌属(Candidatusnitrosotaleasp.)B大约是A、C的20多倍；Dongiasp.A、C大约是B的2倍(图1、表3)。根际土壤细菌优势种是Lactobacillusmurinus、争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)等。鼠乳杆菌(Lactobacillusmurinus)A大约是B、C的2倍；蒂莫内马赛菌(Massiliatimonae)B、C大约是A的2倍；ParaburkholderiacaribensisB大约是A、C的4倍；Rhodospirillaceae bacterium B分别是A、C的3、5倍(图2、表4)。②真菌。根际土壤真菌优势属是Pseudotricharinasp.、镰刀菌属(Fusariumsp.)、被孢霉属(Mortierellasp.)，优势种是Pseudotricharinaintermedia、Coprinopsistrispora等。不同轮作模式根际土壤属水平前30的真菌OTUs 绝对丰度仅赤霉属±90.42 Bb、749.33±117.74 ABa、932.00±362.37 Aa；种水平前30的真菌OTUs 绝对丰度仅错综赤霉Gibberella_intricans有显著性差异，A、B、C分别是 240.67±85.41 Bb、742.00±109.82A Ba、925.33±355.13 Aa，B和C分别是A的3、4倍左右(图3～4)。

表1 不同轮作模式对根际土壤养分和酶活性的影响

表2 不同轮作模式对根际土壤真菌和细菌α-多样性的影响

图1 根际土壤属水平前10的细菌(不含其他)Fig.1 Top 10 bacteria in rhizosphere soil at genus level (not containing ‘others’)

表3 根际土壤属水平前30的细菌OTUs 绝对丰度比较

续表3 Continued table 3

图2 根际土壤种水平前10的细菌(不含其他)Fig.2 Top 10 bacteria in rhizosphere soil at species level (not containing ‘others’)

图3 根际土壤属水平前10的真菌(不含其他)Fig.3 Top 10 fungi in rhizosphere soil at genus level (not containing ‘others’)

Gibberellasp.有显著性差异，A、B、C分别是245.00

图4 根际土壤种水平前10的真菌(不含其他)Fig.4 Top 10 fungi in rhizosphere soil at species level (not containing ‘others’)

2.3 各因素相关性分析

过氧化氢酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶活性和土壤pH值均呈极显著正相关(P<0.01)，真菌多样性和脲酶活性呈显著正相关(P<0.05)，细菌多样性和有效氮呈显著正相关(P<0.05)。几种酶活性之间也有显著或极显著相关性(表5)。

根际土壤细菌、真菌在种水平相互之间具有相关性，与土壤养分、酶活也具有相关性，有的呈负相关，有的呈正相关。过氧化氢酶对微生物种类影响较大，影响细菌Paraburkholderiacaribensis和硝化螺旋菌Nitrospirajaponica等3种微生物的数量。反过来看，与细菌Paraburkholderiacaribensis和硝化螺旋菌Nitrospirajaponica相关的因素最多，尤其受土壤理化因素影响很大。土壤微生物中，Paraburkholderiacaribensis只与Nitrospirajaponica呈极显著正相关，Nitrospirajaponica和Paraburkholderiacaribensis、真菌Humicolasp.呈显著或极显著相关。争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus)受土壤理化性质影响不大，但和鼠乳杆菌(Lactobacillusmurinus4)、芽单孢菌门的Gemmatimonadetesbacterium、酸杆菌科的AcidobacteriaceaebacteriumKBS 96、鞘脂杆菌纲的SphingobacteriiabacteriumWF20、未知真菌GS08 sp.等具有显著负相关关系(表6)。

表4 根际土壤种水平前30的细菌OTUs 绝对丰度比较

表5 根际土壤养分、酶活与微生物多样性间的相关性

3 讨 论

玄参和烟草的3种轮作模式对土壤pH、蔗糖酶活性、碱性磷酸酶活性有显著影响。蔗糖酶可以把土壤中高分子量蔗糖分子分解成能够被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖，其活性反映了土壤有机碳累积与分解转化的规律。碱性磷酸酶对土壤有机磷的矿化及植物的磷素营养有重要影响。可见，烟草玄参轮作一季较好，后面无论再轮作一茬烟草或连作一茬玄参都对会减低土壤酸碱度和酶活。

3种轮作模式对真菌和细菌的多样性均没有显著影响。轮作模式虽然没有改变微生物多样性，但改变了细菌和真菌的种群结构，二者的种类在属、种水平均有显著差异。而细菌差异显著的种类远多于真菌，因为土壤中细菌种类和数量比真菌多，也说明轮作模式对细菌种群的影响比真菌更大。从属水平看，与土壤碳循环相关的苔藓杆菌属(Bryobactersp.)[12]、硝化作用相关的亚硝化杆菌属(CandidatusNitrosotalea)[13]、分解有机质和利用碳源相关的CandidatusSolibacter属[12]的数量，烟草—玄参—烟草远多于烟草—玄参和烟草—玄参—玄参。从种水平看，固氮菌埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)[14]的数量，烟草—玄参—烟草多于烟草—玄参(C)；生防菌蒂莫内马赛菌(Massiliatimonae)[15]的数量，烟草—玄参—烟草多于烟草—玄参—玄参，可见烟草—玄参—烟草有利于提高土壤中部分有益微生物的数量。

表6 排名前10的根际土壤细菌、真菌种水平与土壤养分和酶活性的相关性分析

土壤养分、酶活与微生物多样性有显著或极显著相关性。pH与过氧化氢酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶有极显著正相关，刘莹等[16]发现辽藁本(LigusticumjeholenseNakai et Kitag)根际土壤pH与蔗糖酶、过氧化氢酶活性呈极显著正相关，孙永磊等也发现pH与蔗糖酶活性呈显著正相关[17]；而蔗糖酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶彼此之间也呈显著或极显著正相关，汪子微等[18]发现土壤蔗糖酶和碱性磷酸酶之间呈显著正相关；脲酶与真菌多样性呈显著正相关。土壤脲酶在培肥土壤方面具有重要的作用，它能把高分子化合物水解成为植物和微生物易吸收的营养物质，从而培肥土壤，提高营养物的利用率[19]。脲酶活性强，土壤肥力高，有利于真菌生长；同理，土壤有效氮含量也显著影响细菌的多样性。

根际土壤养分、酶活与细菌、真菌在种水平也具有相关性。如过氧化氢酶对细菌种水平的影响较大，与Nitrospirajaponica呈极显著负相关，Nitrospirajaponica参与土壤硝化作用，它的含量与土壤pH、过氧化氢酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶等多种土壤理化因素呈极显著负相关关系，说明这几种理化因素除了直接影响硝化作用，也通过影响相关微生物种类和数量间接影响硝化作用。

而根际土壤细菌、真菌在种水平相互之间具有相关性。如植物根际抗逆促生细菌争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus)受土壤理化性质影响不大，但和多种细菌和真菌具有显著负相关关系[20-22]。

土壤理化性质和微生物种群结构之间错综复杂的联系可以解释为什么单纯的微生物农药应用于根部病害效果不稳定，因为它的活性除了受其自身数量和活力的影响外，土壤理化性质、土著微生物数量或活性等多种因素都会对它造成直接或间接影响。

这种联系也可以预测化学农药模式不可持续，长时间大剂量应用化学农药在杀灭有害菌的同时，也会杀灭生防菌、有益菌或与有益菌、病原菌有显著相关关系的菌群，造成用药剂量越来越大，效果却越来越差的局面。

此外，为了单纯追求产量和效益，化学肥料、除草剂等的大范围使用改变了土壤的理化性质，直接或间接造成土壤菌群失调，使作物的病害日益严重。

4 结 论

烟草—玄参—烟草轮作比烟草—玄参—玄参连作和烟草—玄参轮作一季土壤微生物构成稍有改善，但并不明显，还对土壤酶活和pH有不良影响，因此，烟草与玄参轮作并非最佳的选择，需要用其他作物与玄参轮作，做进一步的比较。

提高中药材产量和质量，防治病害最根本的方法还是通过优化栽培制度、改良栽培措施、提升施肥技术等手段来恢复土壤活力，从而达到“治未病”的效果。