双生病毒侵染、烟粉虱取食及其互作对番茄生长及防御基因表达的影响

张斐斐,刘圆圆,王炎炎,杨雅云,阿新祥,汤翠凤,董 超,王 斌,胡 剑

(1.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，昆明 650205；2.云南省农业生物技术重点实验室，昆明 650205；3.农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室，昆明 650205；4.农业部云南稻种资源科学观测实验站，昆明 650205； 5.云南省农业科学院国际农业研究所，昆明 650205；6.怒江绿色香料产业研究院，云南 泸水 673199)

【研究意义】近年来，植物病毒—介体昆虫—寄主植物三者互作关系已经成为国际上的研究热点。一方面，植物由于其不可移动性而经常受到不同类型植食性昆虫的取食和病毒的侵染，影响其生长和代谢过程，进而影响植物的产量及品质[1-2]。另一方面，大部分植物病毒需要介体来传播，而昆虫是病毒传播的重要的介体[3-4]。病毒侵染寄主植物后会引起植物体内一系列的生理过程发生变化，也会进一步影响介体昆虫对寄主的选择行为及其生长发育等特性，最终又影响介体对于病毒的传播[1]。它们之间的互作会对其个体及整个互作关系网络中的每个物种的种群动态产生重要影响。因此，植物病毒—介体昆虫—寄主植物三者互作机制的解析有助于为抵抗植物病害与虫害提供新的防控策略。【前人研究进展】烟粉虱[Bemisiatabaci(Gennadius)]为半翅目粉虱科的一类具刺吸式口器的小型昆虫，是一类具有入侵性的农业害虫，包含不少于40个在形态学上不可分辨的隐种[5-6]。不同隐种间在宿主范围、取食习性、病毒传播力、抗药性、内共生菌组成等方面都存在显著差异。烟粉虱的寄主范围广泛，在其生存过程中通过口器取食寄主植物韧皮部的汁液维持生命，进而导致植株衰弱，若虫和成虫在取食过程中还可以分泌蜜露，诱发煤污病的产生，影响果实的品质及价值。此外，烟粉虱还可以传播多种植物病毒，引发多种植物病害，对农业生产造成巨大的损失[3,7-8]。梁鑫等[9]发现B烟粉虱为害可显著降低3种葫芦科寄主植物的株高、茎粗、叶面积和单位面积干重。蔡冲等[10]的研究表明在响应B烟粉虱隐种胁迫时，不同品种之间存在差异，具体表现为抗虫番茄品种响应次生代谢物质含量和防御酶活性的变化更强烈，而感虫品种响应光合参数、活性氧、细胞膜脂过氧化和胰蛋白酶抑制剂活性的变化更强烈。嘎奥云朝伦等[11]研究发现番茄木虱的取食显著提高了番茄叶片抗氧化酶的活性，诱导了抗病蛋白的表达及水杨酸信号途径。【本研究切入点】对双生病毒—烟粉虱—寄主植物三者互作的机制已有一定了解[12-16]，云南本地双生病毒及烟粉虱隐种类型丰富，但云南本地双生病毒优势种、云南烟粉虱优势种与寄主植物三者之间的互作关系还不清楚。【拟解决的关键问题】以不同番茄品种为实验材料，通过接入云南烟粉虱优势种MED隐种取食或接种两种云南本地双生病毒优势种PaLCuCNV和TYLCTHV，探究不同双生病毒、媒介昆虫及其互作对不同番茄品种生长发育及防御基因表达的影响，以期为将来的田间烟粉虱和植物病毒防控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的番茄品种，分别为合作903、荷粉二号、奥尼尔，TYLCTHV(泰国番茄黄化曲叶病毒)和PaLCuCNV(中国番木瓜曲叶病毒)侵染性克隆为毒源，MED隐种烟粉虱为供试虫源。

1.2 试验设计

实验设计分为：处理1(CK)，不对植株做任何处理的对照组；处理2，接种灭菌ddH2O组；处理3，接种PaLCuCNV组；处理4，接种TYLCTHV组；处理5，MED烟粉虱取食组;处理6，接种PaLCuCNV 并放入MED烟粉虱取食组；处理7，接种TYLCTHV 并放入 MED烟粉虱取食组。每处理测量6棵番茄植株，每组实验重复3次。

1.3 试验方法

1.3.1 感毒植株的获取 番茄种子置于25 ℃的温度条件下浸种催芽，2 d后取出，转入基质土(基质∶蛭石∶珍珠盐∶有机肥=5∶1∶1∶1)中育苗，14 d后，移栽到内径为12 cm，高10 cm的花盆。

将PaLCuCNV和TYLCTHV于-80 ℃取出解冻，在YEP固体培养基(含100 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL利福平)上划线，并在28 ℃倒置培养48 h，然后挑单菌落置于20 mL YEP液体培养基(含50 μg/mL卡那霉素、25 μg/mL利福平)中，最后置于温度为28 ℃，转速为200 r/min的摇床中培养16～18 h 至OD值为0.6～0.8时用于接种。番茄长至3～4叶时，用一次性无菌注射器给植株接种PaLCuCNV和TYLCTHV。

1.3.2 病毒检测 接毒14 d后采集叶片，提取DNA，分别用PaLCuCNV(F: 5′-TAGTCATTTCCAC TCCCGC-3′，R: 5′-TGAAAGTCATACTTCGCAGC-3′)和TYLCTHV(F: 5′-CGGAATTCCGCCTTTAATTTGAACTGG-3′，R: 5′-GCGTCGACCTTGCCAACAAAA TAAAGTG-3′)特异性引物进行PCR扩增进行病毒检测。扩增体系20 μL (10×PCR buffer 0.4 μL,dNTPs 1.6 μL,上下游引物(10 μM)各0.4 μL,Taq0.4 μL)，扩增程序为94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，(PaLCuCNV 52 ℃,TYLCTHV 55 ℃)退火30 s,72 ℃延伸10 s，30个循环。

1.3.3 番茄株高的测量 各处理组番茄植株从接毒开始日用刻度尺测量地上部分到植株最顶端的距离，每7 d量取1次，处理5，处理6和处理7中的番茄植株按60头/株的投放量放入烟粉虱取食，所有材料一同置于人工可控温室内进行培养。

表1 荧光定量PCR所用基因及引物序列

1.3.4 植株鲜重与干重测定 剪取各处理组番茄植株地上部分，置于电子天平上称量鲜重，放入托盘中置于80 ℃的烘箱内烘干至恒重，称量干重。

1.3.5 实时荧光定量PCR 将各处理组的幼嫩叶片剪下，加入液氮，用Trizol抽提液提取叶片RNA，用TSINGKE的Goldenstar TMRT6 cDNA Synthesis Mix的反转录试剂盒合成进行反转录，荧光定量的具体方法参照2×TSINGKE Master qPCR Mix试剂盒说明书进行。以UBI基因为内参，所使用引物的信息如表1所示。

1.4 数据统计与分析

采用软件SPSS 17和Sigmaplot 12.5对数据进行处理和制图， 并运用Duncan’s检验法对显著性差异(P<0.05)进行多重比较，数据均为3次重复的平均值。

2 结果与分析

2.1 双生病毒侵染、烟粉虱取食及其互作对不同品种番茄株高的影响

如图1所示，与对照相比， 给植株接种灭菌ddH2O的处理对番茄的株高基本没有影响，而感染PaLCuCNV和TYLCTHV的番茄植株株高显著地降低(P<0.05)。经烟粉虱取食的番茄植株株高比正常植株低2～5 cm，双生病毒感染并伴有烟粉虱取食的番茄植株株高发生大幅度下降。相同处理对不同品种番茄的影响差异较大。病毒和烟粉虱双重影响下，3种番茄品种中合作903的株高降幅最大，奥尼尔次之，荷粉二号的降幅最小，且PaLCuCNV对番茄株高的影响比TYLCTHV的要大。随着时间的推移，各处理组间番茄植株的株高差异越来越显著(P<0.05)。

2.2 双生病毒侵染、昆虫取食及其互作对番茄植株生物量的影响

如图2所示，对荷粉二号植株鲜重与干重的影响由强到弱的是PaLCuCNV与MED烟粉虱互作>MED烟粉虱取食>PaLCuCNV侵染，而对奥尼尔和合作903植株鲜重与干重的影响由强到弱的是PaLCuCNV与MED烟粉虱互作>PaLCuCNV侵染>MED烟粉虱取食。对荷粉二号植株干重的影响由强到弱的是MED烟粉虱取食>TYLCTHV与MED烟粉虱互作>TYLCTHV侵染，对荷粉二号植株鲜重、奥尼尔和合作903的干重和鲜重的影响由强到弱的是TYLCTHV与MED烟粉虱互作>TYLCTHV侵染>MED烟粉虱取食。

2.3 双生病毒侵染、昆虫取食及其互作对番茄防御基因表达的影响

通过实时荧光定量PCR检测SA(水杨酸)和JA(茉莉酸)信号途径中NPRI、LOX、PIII和PRI4个防御基因的表达情况(以荷粉二号的正常番茄植株为对照)，如图3所示。在不同番茄植株中，双生病毒侵染、MED烟粉虱取食和双生病毒-MED烟粉虱互作都会诱发NPRI、LOX、PIII和PRI这几个防御基因不同程度地上调表达。其中，荷粉二号和合作903中基因上调的幅度较奥尼尔的要大，且SA信号途径中的NPRI和PRI的上调幅度较JA信号途径中的LOX和PIII也要大。同一番茄品种中的同一基因，不同的处理所引起的基因表达也是差异显著。以荷粉二号为例，与对照相比，各处理均能引起LOX的上调表达，但上调幅度不一致，以PaLCuCNV与MED烟粉虱互作影响最大，然后分别是MED烟粉虱取食、TYLCTHV与MED烟粉虱互作、TYLCTHV侵染、PaLCuCNV侵染。引起NPRI上调表达的幅度由大到小的处理分别是PaLCuCNV与MED烟粉虱互作、TYLCTHV与MED烟粉虱互作、PaLCuCNV侵染、TYLCTHV侵染和MED烟粉虱取食。引起PIII上调表达的幅度由大到小的处理分别是PaLCuCNV与MED烟粉虱互作、TYLCTHV与MED烟粉虱互作、PaLCuCNV侵染、TYLCTHV侵染和MED烟粉虱取食。引起PRI上调表达的幅度由大到小的处理分别是PaLCuCNV与MED烟粉虱互作、TYLCTHV与MED烟粉虱互作、PaLCuCNV感染、TYLCTHV侵染和MED烟粉虱取食。

A: 合作903；B: 奥尼尔；C: 荷粉二号。CK：不对植株做任何处理的对照组；ddH2O：接种灭菌ddH2O组；PaLCuCNV：接种PaLCuCNV组；TYLCTHV：接种TYLCTHV组；Whitefly：MED烟粉虱取食组；PaLCuCNV + whitefly，接种PaLCuCNV 并放入MED烟粉虱取食组；TYLCTHV + whitefly，接种TYLCTHV 并放入 MED烟粉虱取食组。下同A: Heizuo903; B: Aonier; C: Hefen2;CK:Control; ddH2O:Inoculated with distilled water; PaLCuCNV:Plants infected with PaLCuCNV; TYLCTHV:Plants infected with TYLCTHV; Whitefly:Health tomato plants had whiteflies feeding on them; PaLCuCNV + whitefly:Plants infected with PaLCuCNV and had whiteflies feeding on them; TYLCTHV + whitefly:Plants infected with TYLCTHV and had whiteflies feeding on them; The same as below图1 双生病毒侵染、烟粉虱取食及其互作对番茄株高的影响对番茄株高的影响Fig.1 The effect of virus infection,whitefly feeding,and their interaction on plant height of tomatoes

3 讨 论

植物病毒—介体昆虫—寄主植物三者互作关系微妙而复杂。一方面为抵御病菌与植食性昆虫的危害，植物进化出一套复杂的机制以保证能快速感应并启动防御反应，另一方面，病菌与植食性昆虫也进化出一套相应地躲避或抵制植物防御反应的机制。通常，植食者取食时诱发的植物防御反应会引起植物体内物质分配从生长转向防御，从而抑制植物的生长发育。实验采用人工接毒的方法模拟番茄感毒状态，接灭菌水的番茄植株株高与正常植株无明显差异，可排除实验过程中机械损伤对番茄植株株高的影响，在实验中受到PaLCuCNV和TYLCTHV两种双生病毒侵染的番茄植株其株高明显受到抑制，正常植株放入烟粉虱取食后，其株高也会降低，与有关双生病毒和烟粉虱的危害报道比较一致[19-20]。而实验显示当烟粉虱和病毒共同作用时显著降低了各番茄植株的株高，说明烟粉虱和病毒互作的效果要比它们单作的效果强，且具有加强效应。其次，病毒侵染和烟粉虱取食后，各番茄植株的鲜重和干重与正常植株相比较，均会降低，且病毒侵染组的降幅比烟粉虱取食组的降幅要大，当二者一起作用时，各番茄植株的鲜重与干重更是大幅下降，这说明双生病毒和烟粉虱能够不同程度地影响番茄植株体内水分的运输和干物质的积累，而当二者一起在番茄植株上作用时，这种影响是叠加的，从而降低番茄植株的鲜重与干重。

JA和SA途径为目前已知的参与高等植物防御反应的重要途径[21-22]。有研究表明寄主植物遭受病毒侵染或烟粉虱取食均会引起茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)途径防御基因的表达。脂氧合酶(LOX)是JA合成途径中的重要关键酶，通过脂氧合酶途径合成的茉莉酸甲酯、茉莉酸酮酸和7-异茉莉酸都可激活植物的防御基因，从而在植物的生长发育过程中对环境胁迫反应中起着调控的作用[23]。Shi等[17]研究发现，与其它处理相比，被携带TYLCV的MED烟粉虱取食的番茄植株中JA的含量、JA途径LOX和PIII的表达量都是最低的，显示携带TYLCV的MED烟粉虱能显著抑制寄主植物的防御反应。Lin等[24]研究发现，与对照相比，不同的昆虫及昆虫组合取食都能诱导黄瓜LOX的显著上调表达。实验中，番茄植株在双生病毒侵染和双生病毒与烟粉虱互作双重胁迫下，LOX普遍上调表达，表明JA途径参与了番茄抵御双生病毒侵害与烟粉虱取食的防御反应过程。NPR1是SA信号途径中重要的关键调控蛋白，在植物的免疫反应中发挥重要作用。Shi等[18]发现带毒B烟粉虱取食能诱发SA信号途径NPR1和PR1的上调表达，而带毒MED烟粉虱取食却不能。实验中，不同处理均能诱发番茄NPR1和PR1的上调表达，且整体上调幅度较JA途径中的LOX和PIII的要大，说明不同处理在番茄植株中诱发的 SA信号途径反应更强烈。

HF: 荷粉2号;Aoer: 奥尼尔;HZ: 合作903。不同小写字母表示不同处理、不同材料之间在0.05水平差异显著HF:Heifen2; Aoer:Aonier;HZ:Hezuo903.Different lower-case letter indicated that there was significant difference between different treatment and varieties at the significance level of 0.05图2 双生病毒侵染、烟粉虱取食及其互作对不同番茄植株生物量的影响Fig.2 The impact of virus,insect and virus-insect interaction on tomato biomass

4 结 论

云南本地双生病毒优势种PaLCuCNV和TYLCTHV侵染、MED烟粉虱取食及其互作均能不同程度地影响番茄植株株高和鲜干重，普遍表现为双生病毒-MED烟粉虱互作的影响最大。同一处理对番茄植株株高和鲜干重的影响也呈现出品种间的差异，呈现对合作903的影响最大，奥尼尔次之，荷粉二号的影响最小。此外，不同处理均能诱导SA和JA信号途径中NPRI、LOX、PIII和PRI4个防御基因的上调表达，且SA信号途径中的NPRI和PRI

图3 各植株中防御基因在不同处理下的表达差异Fig.3 Defensive gene expression in tomatoes under different treatments

的上调幅度较JA信号途径中的LOX和PIII也要大。综上所述，植物病毒—介体昆虫—寄主植物之间的互作关系及机制因植物种类、昆虫种类及病毒种类的不同而不同，还需要针对不同的组合情况进一步地深入分析。