云南省荞麦褐斑病病原鉴定及其生物学特性分析

卢文洁，王艳青，孙道旺，尹桂芳，王莉花

(云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所/云南省农业生物技术重点实验室， 昆明 650205)

【研究意义】荞麦(Fagopyrumesculentum)属蓼科荞麦属双子叶植物[1]，起源地为中国西南部[2]。荞麦既可作为粮食作物，又可作为药用作物。荞麦不仅含蛋白质、脂肪等丰富的营养物质[3]，且含芦丁、荭草苷等具有药用价值的黄酮类物质[4]，其中芦丁对 “三高”和毛细血管出血疾病具有一定的预防功效[5]。【前人研究进展】国内外已报道的荞麦病害主要有核立枯病[6]、白粉病[7]、轮纹病[8]、叶枯病[9]、白霉病[10]、根结线虫病害[11]、根腐病[12]、霜霉病[13]等。卢文洁等[14]研究发现，荞麦轮纹病病原菌菌丝适宜生长的温度和pH范围分别为20～28 ℃和4～6 ，菌丝利用率最高的碳源和氮源分别为葡萄糖和蛋白胨。荞麦叶枯病病原菌菌丝适宜生长的温度和pH范围分别为20～28 ℃和6～9 ，菌丝利用率最高的碳源和氮源分别为麦芽糖和硝酸钠[11]。李琼等[12]研究发现，荞麦白霉病病原菌菌丝适宜生长的温度和pH范围分别为15～25 ℃和5～6，菌丝利用率最高的碳源和氮源分别为可溶性淀粉和蛋白胨。【本研究切入点】随着荞麦种植面积的不断扩大，种植品种常年单一化，加上田间管理粗放等因素，荞麦病害种类不断增加，危害程度逐年加重。近年来，在云南省会泽县荞麦试验基地发现一种发生普遍的病害—荞麦褐斑病。发病始于6月中下旬开始，7—8月尤为严重，植株发病率可达10%左右，给荞麦生产造成了严重影响。【拟解决的关键问题】通过对云南省荞麦褐斑病样品进行组织分离、病原菌接种及rDNA-ITS序列分析，明确病原菌的种类，并分析培养基、温度、光照等对病原菌生长的影响，从而为荞麦褐斑病的发病规律、防控技术及荞麦抗病育种研究提供有一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试荞麦样品

在云南省会泽县马路乡荞麦试验种植区采集感染褐斑病的荞麦叶片，记录及拍照叶片症状，将病叶带回实验室于4 ℃保存备用。

1.2 荞麦褐斑病病原菌的分离

采用真菌组织分离法，取荞麦褐斑病样品剪大小约5 mm × 5 mm的病叶组织，于75%乙醇浸泡10 s，再用2%次氯酸钠浸泡5 min，ddH2O冲洗3遍，于灭菌吸水纸上晾干，接种于PDA培养基，25 ℃恒温培养3 d，将纯化菌株移植于PDA斜面25 ℃恒温培养7 d，并于4 ℃保存备用。

1.3 荞麦褐斑病菌株的致病性

将分离纯化得到的菌株，接种到活体荞麦植株进行致病性测定。菌株在PDA培养基上25 ℃恒温培养3 d，用打孔器(直径 6 mm) 打取菌块，用灭菌接种针轻轻针刺健康叶片3针制造伤口，接种菌块于伤口处，伤口处接种PDA为对照(CK)，菌株和CK均接种15个健康荞麦叶片，接种24 h后移去菌块，观察接种叶片发病情况。

1.4 荞麦褐斑病菌株的鉴定

1.4.1 菌株的菌落及孢子形态 将菌株接种于PDA培养基，置于25 ℃恒温条件下全黑暗培养3～7 d后，观察菌落的大小、颜色、形状等特征。挑取少量的菌丝于载玻片上，于DM400型显微镜下观察分生孢子的大小、生长方式、形状等特征。

1.4.2 菌株的rDNA-ITS序列分析 将菌株接种于PDA培养基，置于25 ℃恒温条件下全黑暗培养3 d，采用真菌基因组DNA提取试剂盒抽提菌丝基因组DNA。采用真菌通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增[15]，引物由生工生物有限公司合成。PCR扩增体系：ITS1、ITS4各1 μL、菌株DNA 1 μL 、2×MasterMix 12 μL，ddH2O 10 μL，总体积为25 μL 。PCR反应条件及DNA片段回收方法参照卢文洁等研究发表的相关文献[9]。菌株rDNA-ITS 序列于NCBI 上进行BLAST 比对，用MEGA 6.0软件分析菌株的DNA序列，并构建序列的系统发育树。

1.5 荞麦褐斑病菌株的生物学特性

1.5.1 温度对菌株菌丝生长的影响 取直径为6 mm的菌块移植于PDA培养基平板上，分别置于5～35 ℃ 7个温度梯度(每个梯度间隔5 ℃)及28 ℃恒温条件下全黑暗培养3 d ，每个温度处理为5次重复，测量菌落直径采用十字交叉法[9]，测量方法下同。

1.5.2 菌株的致死温度 取直径为6 mm的菌块于装有2 mL ddH2O的无菌试管中，置于35～65 ℃共7个温度梯度(每个梯度间隔5 ℃)的水浴锅中加热，每个温度加热10 min，取出冷却后，将菌块晾干，接种于PDA培养基平板上，每个水浴温度处理为5次重复，25 ℃恒温条件下全黑暗培养3 d ，观察菌丝的生长情况。

1.5.3 培养基对菌丝生长的影响 取直径为6 mm的菌块，分别置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基、查彼(Czapek)培养基、胡萝卜琼脂(CA)培养基、燕麦片琼脂(OMA)培养基、沙氏葡萄糖琼脂(SDA)培养基、玉米粉琼脂(CMA)培养基上，以WA培养基作为对照，每个处理为5 次重复，25 ℃ 恒温条件下全黑暗培养3 d，测量菌落直径。

1.5.4 光照对菌株菌丝生长的影响 取直径为6 mm的菌块移植于PDA培养基平板上，分别于全天光照、光暗12 h交替、全天黑暗3种不同的光照条件下，每个光照处理为5次重复，25 ℃恒温条件下培养3 d，测量菌落直径。

1.5.5 pH 对菌株菌丝生长的影响 采用盐酸溶液(1 mol/L)和氢氧化钠溶液(1 mol/L)调节PDA 培养基溶液的pH至4～12共9 个梯度(每个梯度pH为1)，取直径为6 mm的菌块移植于不同pH 得PDA培养基平板上，每个pH处理为5次重复，25 ℃恒温条件下全黑暗培养3 d ，测量菌落直径。

1.5.6 碳源、氮源对菌株菌丝生长的影响 以PDA培养基(葡萄糖的碳元素含量为2%)为基础培养基，分别用7种碳源等质量置换PDA培养基中的碳元素，7种碳源分别为木糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、乳糖、甘露糖、麦芽糖，以不加碳源的PA培养基为对照(CK)；以加入硝酸钾的PDA培养基(硝酸钾氮元素含量为0.2%)为基础培养基，分别用8种氮源等质量置换PDA+硝酸钾培养基中的氮元素，8种氮源分别为苯丙氨酸、氯化铵、牛肉浸膏、硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨、胱氨酸、尿素，以不加氮源的PDA培养基为对照(CK)。取直径为6 mm的菌块，分别移植于含有不同碳源、氮源的培养基上，每个碳源、氮源处理均为5 次重复，25 ℃恒温条件下全黑暗培养3 d ，测量菌落直径。

1.6 数据分析

采用Excel、SPSS及复极差法[9]对生物学实验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 荞麦褐斑病症状及菌株致病性

在荞麦大田叶片感染发病初期，叶部出现不规则退绿症状，随着病情发展，叶部出现近圆形或不规则淡黄色至褐色病斑，边缘赤褐色，病斑周围呈现退绿色晕圈(图1-A,1-B)。病情严重时，病斑几乎布满叶片，高温高湿条件下，叶片干枯脱落。菌株S62R5接种荞麦健康叶片7 d 后，接种点可见黄色近圆形病斑，病斑边缘颜色较深，病斑周围呈现退绿晕圈，接种症状与荞麦田间自然发病相似(图1-C)，菌株致病率高达98.5%。PDA培养基对照接种叶片未出现症状(图1-D)。接种发病叶片经再次分离、纯化获得的分离株与接种试验所用的菌株在菌落形态及分生孢子的形态特征上完全一致，证明接种分离株即为荞麦褐斑病的致病菌。

2.2 菌株的形态学鉴定

菌株S62R5 的菌落疏松，前期菌丝为白色绒毛状，气生菌丝生长迅速，后期菌落由白色逐渐变为灰色，最后变为黑色(图2-A,2-B))。分生孢子梗单生，多数直立，具隔膜。分生孢子扁球形或球形，单胞、光滑，生于无色透明的瓶状细胞上，分生孢子初期呈黄褐色(图2-C,2-D)，后期为黑色(图2-E,2-F)，大小为10～15 μm，根据形态特征初步将菌株S62R5鉴定为半知菌亚门黑孢霉属(Nigrospora) 真菌[16]。

2.3 菌株的分子鉴定

以菌株S62R5的DNA为模板，采用引物ITS1/ ITS4进行PCR 扩增，测序获得553 bp (KR002908.1) 的rDNA-ITS序列。该序列通过在NCBI GenBank上进行BLAST 比对，选取球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)、稻黑孢(Nigrosporaoryzae)、海南黑尾孢菌(Nigrosporahainanensis)、巴氏黑孢菌(Nigrosporabambusae)等菌株的序列进行多重比较及系统发育树分析，菌株S62R5的rDNA-ITS 序列与稻黑孢菌株R11F1(EU529994.1)的同源性达100%， 与稻黑孢遗传距离最小， 聚为一支，且支持率达99%(图3)，结合菌株S62R5的形态特征， 最终将菌株鉴定为稻黑孢(Nigrosporaoryzae)。

2.4 菌株的生物学特性

2.4.1 温度对菌丝生长的影响 菌丝在25、28 ℃温度下的平均菌落直径分别为85.03 、84.44 mm，二者处理间无显著差异，且平均菌落直径明显高于其他温度处理，表明菌丝生长的最适温度为25、28 ℃。其次在30 ℃温度下菌丝生长较快，平均菌落直径为77.29 mm，在10、15 、35 ℃温度下菌丝生长缓慢，平均菌落直径分别为20.57、24.14、25.87 mm，在5 ℃下菌丝生长极为缓慢(图4)。

菌块经40、45、50、55、60、65 ℃水浴处理10 min后，移植于PDA培养基平板上25 ℃恒温培养，经观察发现，40、45、50 ℃水浴处理的菌块培养5 d后均能长出菌丝，55、60、65 ℃水浴处理的菌块培养10 d后未长出菌丝；将菌块分别于51、52、53、54 ℃水浴处理10 min，移植于PDA培养基平板上25 ℃恒温培养， 51、52 ℃水浴处理的菌块培养5 d后长出菌丝，53、54 ℃水浴处理的菌块培养10 d后未长出菌丝，由此可知，菌丝的致死温度为53 ℃，10 min。

A～B: 田间症状；C:接种症状; D:对照A-B: Symptom in the field; C:Symptom on inoculated leaves; D:Control图1 荞麦褐斑病症状Fig.1 Symptoms of buckwheat brown spot

A：PDA正面菌落形态；B：PDA背面菌落形态；C～D：未成熟分生孢子；E～F：成熟分生孢子A：Colony morphology of the positive side on the PDA plate；B：Colony morphology of the contrary side on the PDA plate；C-D：Immature conidia；E-F：Mature conidia 图2 菌株S62R5的菌落及分生孢子形态特征Fig.2 Colony and conidia morphological characteristics of strain S62R5

图3 菌株S62R5rDNA-ITS序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree analysis of strain S62R5 of rDNA-ITS sequence

2.4.2 培养基对菌丝生长的影响 菌丝在PDA和PSA培养基上生长快，平均菌落直径分别为84.03、80.53 mm，二者间无显著差异，其次菌丝在CA、CMA、OMA培养基上生长较快，平均菌落直径分别为60.74、58.55、57.84 mm，3种处理与PDA、PSA有显著差异，但三者间无显著差异，在Czapek、SDA培养基上平均菌落直径分别为52.90、50.01 mm(图5)。菌丝在PDA培养基和PSA培养基上生长最快，且菌落致密，表明PDA培养基和PSA培养基最适生长。

2.4.3 光照条件对菌丝生长的影响 菌丝的平均菌落直径在全天光照、光暗交替(12 h交替)、全天黑暗3种条件下依次为66.09、63.90、70.0 2 mm，3种处理间无显著差异(图6)，且3种条件下菌丝的

图中大、小写字母分别表示在0.01和0.05水平的差异显著性，下同The capital and lowercase letters indicated significant difference at 0.01 and 0.05 levels, respectively, the same as below图4 温度对菌株S62R5菌丝生长的影响Fig.4 Effects of mycelia growth of strain S62R5 by different temperatures

平均生长速率分别为22.03、21.30、23.34 mm/d，菌丝在全黑暗条件下的生长速率比全光照和光暗交替条件下的生长速率稍高，由此可见光照对菌丝生长影响较小。

2.4.4 pH对菌丝生长的影响 菌丝的平均菌落直径从pH 4至pH 12依次为47.50、61.00、70.29、65.00、59.32、60.14、46.53、51.41、31.92 mm，各处理间差异显著。菌丝在9种不同的pH条件下均能生长，但在pH=12时菌丝生长极为缓慢，菌丝在pH=6时生长最快，平均生长速率为23.43 mm/d，菌落致密，表明pH=6最适菌丝生长(图7)，因此菌丝在偏酸性的条件下适宜生长。

图5 培养基对菌株S62R5菌丝生长的影响Fig.5 Effects of different media on mycelia growth of strain S62R5

图6 光照对菌株S62R5菌丝生长的影响Fig.6 Effects of mycelia growth of strain S62R5 by different illumination conditions

图7 pH值对菌株S62R5菌丝生长的影响Fig.7 Effects of mycelia growth of strain S62R5 by different pH values

2.4.5 碳源对菌丝生长的影响 菌丝在PDA(葡萄糖为碳源)培养基、PSA(蔗糖为碳源)培养基上生长最快，平均菌落直径分别为84.03、80.53 mm，二者间无显著差异，并显著高于其他处理，其次在以可溶性淀粉和果糖为碳源的培养基上生长较快，平均菌落直径分别为67.34 、64.13 mm，在以木糖为碳源的培养基上菌丝生长最慢，平均菌落直径为17.45 mm(图8)。

2.4.6 氮源对菌丝生长的影响 菌丝在PDA+氯化铵培养基(以氯化铵为氮源)上生长最快，平均菌落直径为81.73 mm；其次在以硫酸铵、硝酸钠为氮源的培养基上生长较快，平均菌落直径分别为78.56、74.36 mm，在以尿素为氮源的培养基上生长最慢，平均菌落直径为18.47 mm，菌丝生长速度显著低于其他处理，表明尿素明显抑制菌丝生长(图9)。

图8 碳源对菌株S62R5菌丝生长的影响Fig.8 Effects of mycelia growth of strain S62R5 by different carbon sources

图9 氮源对菌株S62R5菌丝生长的影响Fig.9 Effects of mycelia growth of strain S62R5 by different nitrogen sources

3 讨 论

稻黑孢菌(Nigrosporaoryzae)属半知菌亚门丝孢纲丝孢目暗色孢科黑孢霉属真菌[16]，是一种寄主范围广泛的病原菌。该病原菌能够引起棉花腐烂病[17]、草地早熟禾叶斑病[18]、芦荟叶斑病[19-20]、水稻褐斑病[21]、水稻圆斑病[22]、水稻穗部病害[23-25]、西瓜叶斑病[26]、猕猴桃褐斑病[27]、蓝莓叶斑病[28]、铁皮石斛叶斑病[29]、毛地黄叶斑病[30]等多种植物病害。

通过对病原菌进行分离纯化、致病性测定、孢子形态观察及DNA序列分析，引起荞麦褐斑病的病原鉴定为稻黑孢菌(Nigrosporaoryzae)。观察菌株S62R5的菌落和孢子形态，菌落的形态、颜色及分生孢子的着生方式、形状、颜色等与台莲梅等[23]研究报道的水稻穗褐变病病原菌(N.oryzae)基本一致。

对生物学特性研究表明，菌株S62R5的菌丝在温度10～35 ℃均能生长，在5 ℃时菌丝基本停滞生长，菌丝利用率最高的碳源为葡萄糖和蔗糖，费丹等[25]对水稻穗腐病病原菌(N.oryzae)的研究也有此结果。菌株S62R5的菌丝在pH=6微偏酸性条件下生长最快，李茂青等[31]研究稻黑孢(N.oryzae)在pH=5条件下生长也有相似结果。菌株S62R5的菌丝利用率最高的氮源为氯化铵，与费丹等[25]对稻黑孢(N.oryzae)氮源利用率的研究结果存在差异。光照对菌株S62R5的菌丝生长影响较小，与李茂青等[31]对稻黑孢(N.oryzae)的研究结果有差异。

对荞麦褐斑病的防治，可通过合理的栽培措施，促使植株生长健壮，抵抗病菌侵染。在病害发病初期，可施用石灰改变病原菌的生存环境，抑制病害的扩展蔓延。作物收获后，利用病原菌不耐高温的特性，收集田间病残叶，集中高温处理，以减少次年的病菌初侵染源。

4 结 论

通过鉴定病原菌，明确了引起云南省荞麦褐斑病的病原菌为稻黑孢菌(N.oryzae)。研究生物学特性表明，该病原菌菌丝生长的最适培养基为PDA和PSA，最适温度为25和28 ℃，致死温度为53 ℃，10 min，最适pH为6；最适碳源为葡萄糖和蔗糖，最适氮源为氯化铵。因此，研究结果可为生产上有效防控该病菌提供科学依据。