基于高通量绝对定量对不同树龄茶树土壤细菌群落多样性的研究

浦 滇，石 明，周雪孟，张仲富，蓝增全

(1．西南林业大学生态与环境学院，昆明 650224；2.西南林业大学林学院，昆明 650224；3.西南林业大学湿地学院，昆明 650224；4.西南林业大学绿色发展研究院，昆明 650224)

【研究意义】茶树是多年生木本植物，在中国作为一种重要的经济作物，其树龄可达百年以上。但大多茶园在植茶20年左右其经济效益开始下滑，其主要原因是茶树土壤质量下降导致的茶树产量及品质下降[1-2]。【前人研究进展】研究表明，土壤微生物种群、数量、活性和养分是影响茶树生长和茶叶品质的关键因素[3]。土壤微生物是土壤生态系统的核心，参与了土壤养分循环、有机质转换、土壤肥力形成等[4-7]。细菌是土壤中数量最多、分布最广的微生物，占土壤微生物总数的70%～90%[8]。在土壤微生物的研究中最常用的是经典分离培养法和稀释平板法，但土壤微生物数量巨大、种类繁多，每克土壤中约含数万个物种，而其中仅有1%的物种可以分离培养，传统的方法遗漏了土壤中的绝大部分微生物，难以反映土壤微生物的群落丰度及其作用机制[9]。随着高通量测序技术的发展，如IIIumina MiSeq/Hiseq测序，可以很容易的获得样本中微生物群落的相对丰度信息[10-14]。近年来，高通量测序的方法也被广泛用于茶园土壤微生物群落的研究中[2,15-19]。【本研究切入点】常规的高通量测序只能检测微生物群落的相对丰度，由于相对丰度以总样本的比例表示，用相对丰度来反映种群的实际丰度可靠性不足[10,20]，高通量绝对定量的方法较好的解决了环境样本中微生物绝对定量的问题，同时还可以得到环境样本中的物种组成信息。目前，高通量绝对定量方法主要有多方法联合和内标物质法。多法连用原理是将流式细胞仪、qPCR、PLFA等方法的生物量测定结果与高通量测序结果相结合后进行计算，多法连用应考虑多种方法获取数据的一致性，否则会影响结果的准确性[21-25]。内标法的第一种方法是向样品DNA中添加一定量已知拷贝数的外源已知菌株或DNA后进行常规扩增子测序，最后通过内标菌株的绝对数量及扩增获得的相对丰度，可以计算出样本中的微生物绝对丰度，内标菌株是自然界中已知存在的，测试样本中可能会包含，且只有单个标准点，没有引入标准曲线，可靠性不易验证[26]。第二种则是添加一定量spike-in standards人工合成序列进行16S扩增子文库构建、测序，再根据spike-in standards 的16S扩增子reads数及其绝对拷贝数绘制标准曲线，计算出样品中OUT/ASV代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数，该方法添加的序列为人工合成，与自然界中微生物序列相比具有特异性，从而避免了样本中出现类似的片段，使得计算、分析更加准确[27]。【拟解决的关键问题】采用高通量绝对定量测序技术，对树龄10(10yrs)、40(40yrs)、80(80yrs)和100年以上(100yrs)的茶树土壤和相邻没有茶树种植历史的林地(0yrs)土壤进行研究，分析随着茶树树龄的变化，土壤细菌群落的多样性和绝对丰度的变化趋势，为改善茶树土壤环境提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验地位于云南省临沧市双江县勐库镇冰岛村(23°47′N，99°54′E)。该村属亚热带季风气候，海拔1400～2500 m，年平均气温18～20 ℃，年降雨量约1800 mm，土壤类型为黄棕壤。茶树种植以勐库大叶种为主，属山茶属(Camellia)普洱茶种(Camelliasinensisvar.assamica)。据史料《双江傣族简史》记载以及双江县人民政府派员考证，该村500年以上树龄的古茶树尚存30余株(1980年)，根据2002年的调查，基部直径0.3～0.6 m的古茶树近2000棵[28]。选取有明确种植历史树龄为10年(10yrs)、40年(40yrs)、80年(80yrs)和100年以上(100yrs)的茶树及周围没有茶树种植历史的林地(0yrs)表层土壤作为研究对象。茶园具有相同的农业管理措施，2015—2020年均未施肥，每年3和8月采用机械除草，11月对茶树进行修剪，修剪后的枝叶、杂草留在茶园。

1.2 样品采集与处理

2020年8月在20 m×20 m的样方内，按照“S”型随机多点混合取样，去除茶树树冠下的枯枝落叶后，用土钻随机采集4～6个点0～20 cm的表层土壤混匀后作为一个样品，每个样地3个重复。采集的土壤一部分放入土壤采样瓶后立马放入液氮罐，用于提取土壤微生物的总DNA；另一部分装入无菌密封袋带回实验室自然风干，用于测量土壤理化性质。

1.3 实验方法

1.3.1 土壤理化成分测定 土壤pH采用(水土比1∶2.5)电位法；土壤有机质(SOM)采用重铬酸钾氧化—外加热法；总氮(TN)采用半微量凯氏定氮法；土壤总磷(TP)采用酸溶—钼锑抗比色法；有效磷(AP)采用氟化铵—盐酸浸提比色法；有效氮(AN)采用碱解—扩散法；总钾(TK)采用碱溶—火焰光度计法。

1.3.2 土壤微生物DNA提取 土壤细菌DNA采用Powersoil®DNA isolation kit提取，具体提取步骤参照说明书。

1.3.3 土壤细菌序列的扩增及测序 DNA样品委托上海天昊生物科技有限公司进行扩增和测序。首先用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，NanoDrop 2000超微量分光光度计检测基因组DNA质量，选择合格的样品(电泳条带清晰可见，无明显降解；浓度≥20 ng/μL，总量≥500 ng，OD260/280=1.8～2.0)使用上游引物：Illumina adapter sequence 1+ GTGCCAGCMGCCGCGG和下游引物：Illumina adapter sequence 2+ CCGTCAATTCMTTTRAGTTT对细菌16S rRNA基因V4～V5区进行高保真PCR扩增，每个样本3个重复，同时以标准细菌基因组DNA mix作为阳性对照。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，DNA质控合格且扩增成功的样本才为合格。检测合格后的样本按照Jiang等[27]的方法对目标区域检测扩增和添加特异性标签序列。利用Qubit对文库进行精确定量后，按相应比例(摩尔比)混合样本。混样后的文库通过Agilent 2100 Bioanalyzer检测测序文库插入片段的大小，确认在120～200 bp无非特异性扩增，并准确定量测序文库浓度。采用Miseq平台，2×250 bp的双端测序策略对文库进行测序，后续进行生物信息学分析。

1.4 统计分析

由于构建文库的需要，原始测序数据中包含了一些人工添加物，使用QIIME2软件的cutadapt插件去除后再用 DADA2插件对数据进行质量过滤，降噪，拼接及去嵌合体(默认参数：p-max-ee=2.0，p-trunc-q=2，p-chimera-method=consensus，每个样本有效序列不少于15万条)，质控后通过该插件直接生成扩增序列变体[29](Amplicon sequence variant，ASV；类似于操作分类单元，Operational taxonomic units，OTU)；根据每个样本spike-in序列制作的标准曲线方程，计算每个样本中的ASV的绝对拷贝数(计算公式：单位样本中ASV绝对拷贝数 = (ASV绝对拷贝数×样品DNA提取量) /测序模板DNA量/抽提DNA所用样品量)；最后，按照0.8的置信度进行物种注释。用R软件(v3.5.1)的ggplot2包(v3.3.0)、vegan包(v2.5.6)、pheatmap包(v1.0.12)等进行统计分析和数据可视化；用SPSS 25.0统计软件对土壤理化性质进行方差分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质分析

由表1可知，不同树龄的茶树土壤和林地土壤的理化性质随树龄的变化呈不同的变化规律，且差异显著(P<0.05)。总氮(TN)、有效氮(AN)含量随茶树树龄的增加呈先减小后增加的趋势；总磷(TP)含量随茶树树龄的增加而减小，在林地(0yrs)土壤和树龄40年(40yrs)的茶树土壤差异不显著；有效磷(AP)含量随茶树树龄的增加有减小的趋势，但在40(40yrs)、80(80yrs)和100以上(100yrs)的茶树土壤和林地(0yrs)土壤中差异不显著；总钾(TK)含量在10年(10yrs)的茶树土壤中最低，林地(0yrs)、40(40yrs)、80(80yrs)和100年以上(100yrs)的茶树土壤之间差异不显著；土壤有机质(SOM)含量随茶树树龄的增加而增加，茶树树龄40(40yrs)和80年(80yrs)的差异不显著，林地(0yrs)土壤和100年以上(100yrs)的茶树土壤中含量最高，但差异不显著；茶树土壤pH随着茶树树龄的增加而降低，且均显著低于林地(0yrs)土壤。

2.2 土壤细菌群落多样性

为了得到高质量的测序数据，以提高后续生物信息分析准确性，使用QIIME2软件的DADA2插件对数据进行质量过滤，降噪，拼接及去嵌合体，5个样本共得到921 751条序列。稀释性曲线见图1(左)，曲线随着抽取序列数目的增加而趋于平缓，从表2中可以看出，所有样本覆盖率都在99%以上，表明这些数据可以真实有效的反应样本环境的细菌多样性。Chao1和ACE指数的变化趋势与Observed一致，表现为10yrs>0yrs>40yrs>80yrs>100yrs。10yrs的Observed、Chao1、ACE和Shannon指数最高，并且随树龄的增加而减小，表明10yrs的土壤细菌群落多样性最高，并且随着树龄的增加土壤细菌群落多样性呈下降的趋势。图1的稀释曲线和Rank-abundance曲线得出的结论与此一致。

2.3 土壤细菌群落组成和绝对丰度

细菌在门水平上(图2)，共检测出43个门，其中相对丰度大于1%的共19个。分别为Acidobacteria(酸杆菌门，23.71%～39.70%)、Proteobacteria(变形菌门，17.20%～24.98%)、Chloroflexi(绿弯菌门，5.33%～13.67%)、Planctomycetes(浮霉菌门，4.99%～8.59%)、Actinobacteria(放线菌门，3.57%～9.91%)、Myxococcous(粘球菌门，2.57%～7.65%)、Gemmatimonadetes(芽单胞菌门，2.41%～5.04%)等菌门。从图2可以看出，在细菌总量绝对丰度层面，随着树龄的增加细菌的总绝对丰度呈先增加后减小的趋势，40yrs的土壤细菌绝对丰度最高且高于林地，40年后细菌群落总绝对丰度开始下降，80yrs的土壤细菌总绝对丰度与林地相比没有明显差异，表现为40yrs>0yrs>80yrs>10yrs>100yrs。

表1 茶树和林地土壤理化性质

图1 稀释曲线(左)和Rank-abundance曲线(右)Fig.1 Rarefaction curve(left)and Rank-abundance curve(right)

表2 不同树龄茶树土壤和林地土壤细菌多样性比较

图2 在门水平林地及不同树龄茶树的土壤细菌群落组成Fig.2 Soil bacterial community composition of forest land and tea trees with different ages at phylum level

图3 林地及不同树龄茶树土壤细菌群落共有和独有ASV韦恩图Fig.3 Venn diagram of unique and shared ASVs of the soil bacterial community in forest land and tea trees with different ages

图4 门水平上林地及不同树龄茶树土壤细菌的绝对丰度聚类热图Fig.4 Clustering heatmap of absolute abundance of soil bacterial community in forest land and tea trees with different ages at phylum level

此外，丰度最高的Acidobacteria(酸杆菌门)，植茶后的相对丰度高于林地，且随着植茶年限的增加绝对丰度呈上升的趋势，80和100yrs的相对丰度差异较小(80yrs，39.70%；100yrs，39.60%)，但绝对丰度随着树龄的增加呈先增加后减小的趋势，40和100yrs的绝对丰度差异较小。

为进一步揭示林地和不同树龄茶树的土壤细菌群落的特性与共性，5个样品共检测出16 269个ASV，基于ASV丰度绘制的韦恩图(图3)中可以看出，5个样本共有248个ASV，10yrs的茶树土壤细菌特有的ASV个数最高(2304个)，高于林地和其他树龄的土壤细菌，植茶后特有的ASV个数随着植茶年限的增加而减小。

为了能够更明显和准确的反映出5个样本的物种组成相似性和差异性，根据检测出的43个门水平上的细菌绝对丰度和不同样本间的距离绘制了细菌门水平的热图(图4)。随着树龄的增加土壤细菌群落绝对丰度发生变化，0和10yrs的土壤细菌群落结构较为相似，40和80yrs的土壤细菌群落结构更为相似，而100yrs的土壤细菌群落与其他树龄茶树土壤和林地土壤的细菌群落结构差异较大。

图5 林地及不同树龄茶树土壤细菌群落的主坐标分析Fig.5 Principal coordinates analysis (PCoA) of soil bacterial community in forest land and tea trees with different ages

蓝色越深表示负相关性越强，橙色越深表示正相关性越强。方格上的*和**分别表示0.05和0.01水平上差异显著The darker the blue, the stronger the negative correlation, and the darker the orange, the stronger the positive correlation. The * and * *on the grid indicated significance at 0.05 and 0.01 level，respectively图6 属水平上土壤细菌群落与理化因子相关性热图Fig.6 Thermogram of correlation between soil bacterial community and physical and chemical factors at genus level

基于5个样本的ASV代表序列构建系统进化树，结合代表序列进化关系，计算样本间的距离进行了PCoA(主坐标分析)分析，结果表明，不同样本的土壤细菌结构组成具有一定的相似性和差异性，与上述聚类热图(图4)的分析结果一致。

2.4 土壤细菌群落与土壤理化因子的关系

对属水平上的土壤细菌与土壤理化因子间进行Spearman相关性热图分析(图6)，结果显示，土壤pH、总氮(TN)、总钾(TK)、有效氮(AN)、有效磷(AP)对土壤细菌群落影响较大。土壤pH与Sumerlaea、Solirubrobacter(土壤红色杆形菌)、Haliangium等28属的细菌呈正相关，与Methanomethyliaceae等2属呈负相关；总钾(TK)与Bdellovibrio(蛭弧菌属)等9属呈正相关，与Lactobacillus(乳杆菌属)等6属呈负相关；有效磷(AP)和总磷(TP)与Ferruginibacter等5属呈正相关，与Acinetobacter(不动细菌属)等4属呈负相关；水解性氮(AN)与Shimazuella等6属呈正相关，与Bdellovibrio等7属呈负相关；总氮(TN)与Dactylosporangium(孢囊菌属)等2属呈正相关，与Acidiphilium(嗜酸菌属)等两属呈负相关；土壤有机质(SOM)与Puia等2属呈正相关，与Flavisolibacter(黄色土源菌属)等5属呈负相关。

3 讨 论

茶树是一种喜酸植物，在pH为4.0～6.5的土壤中能够正常生长，最适宜pH为4.5～5.5，当pH低于4.0时茶树的生长会受到限制，从而影响茶叶产量与品质[30]。已有大量研究表明，植茶后茶园土壤逐渐酸化，并且土壤pH随着树龄的增加而减小[16,31-34]。本研究表明，与林地相比，植茶后土壤pH显著降低，并随树龄的增加而减小，与前人研究有相同结果。张小琴等[35]对贵州植茶年限分别为1～2、6～10、15～20、25～30年的茶园土壤研究，土壤有机质(SOM)、总氮(TN)含量随植茶年限的增加而增加，李贞霞等[36]对河南植茶10、20、30、40年的土壤研究表明，土壤有机质(SOM)、有效氮(AN)含量随植茶年限的增加而增加。通过研究显示植茶后SOM含量随树龄增加而增加，总氮(TN)和有效氮(AN)含量40yrs后随树龄增加而增加。这可能是随着茶树年限的增加，茶园修剪枝和凋落物逐渐增多导致的土壤有机质增加，同时也是总氮增加的间接原因[35]，此外，茶树修剪物和凋落物以及杂草分解时会带来苹果酸、草酸、柠檬酸等，土壤中酸性物质的增加，进而降低了土壤pH[37]。可见，随树龄的变化会显著影响土壤的理化性质。土壤细菌群落与土壤理化因子相关性热图分析表明，土壤pH、总氮(TN)、总钾(TK)、有效氮(AN)、有效磷(AP)对土壤细菌群落影响较大，这与许广等[16]研究也有相似结果。

姚泽秀等[38]采用T-RFLP技术对不同植茶年限的土壤微生物群落研究，随着树龄的增加茶树土壤细菌群落多样性呈下降的趋势。通过16S rRNA高通量绝对定量测序的方法对不同树龄茶树土壤和林地土壤细菌进行研究，植茶后土壤细菌群落多样性随树龄的增加而减小，与前人研究也有一致结果。从图1可以看出，40yrs的茶树土壤细菌数量绝对丰度最高且80yrs的土壤细菌数量绝对丰度和0yrs的差异较小，随树龄的增加土壤细菌群落数量的绝对丰度呈先增加后减小的趋势，细菌数量总绝对丰度表现为40yrs>0yrs>80yrs>10yrs>100yrs。王海斌等[39]通过PLFA和实时荧光定量PCR方法结合研究茶树土壤细菌发现，随树龄的增加土壤细菌数量呈先上升后下降的趋势，许广等[16]通过传统培养法和高通量测序技术结合对不同植茶年限的土壤细菌群落研究发现，土壤细菌数量随植茶年限的增加呈下降的趋势，韩文炎等[40]通过实时荧光定量PCR技术对不同植茶年限和附近林地的土壤微生物16S rRNA基因研究，当森林土壤转变为茶园土壤后，一定年限内有利于提高土壤微生物的数量。虽然研究方法不同，但得到的结果具有一定的相似性，共同表明了植茶一定年限后土壤细菌的丰度和多样性降低。Peter等通过对土壤中细菌的16S rRNA基因进行研究发现[41]，Proteobacteria(变形菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Actinobacteria(放线菌门)等菌门是土壤中是主要的优势门。通过对林地土壤和不同树龄茶树土壤细菌群落的研究验证了这一结论。Heatmap(热图)和PCoA(主坐标)分析表明，植茶后除40yrs的土壤细菌群落和80yrs的差异较小外，其余样本中土壤细菌群落距离较远，表明不同树龄的茶树土壤细菌群落结构存在差异。土壤中细菌虽是土壤微生物中占比最高的，实际上其他种类的微生物群落也发挥着重要的作用，如茶园土壤中的一些真菌可以提高茶叶的产量和品质[42]。

古茶树是指树龄大于100年的原生地、天然生长或栽培型的茶树[43]。100yrs的茶树即为古茶树，100yrs的茶树土壤细菌多样性和绝对丰度明显低于其它树龄和周围没有茶树种植历史的林地，细菌群落的多样性和绝对丰度的降低可能会导致古茶树产量和品质的下降。古树茶被看作含有特异的生化成分，近年来古树茶炒作严重，有的地方甚至连年拍卖，过度采摘，最终导致古茶树的产量减少、品质下降生存状况恶化。茶树作为一种重要的经济作物，其品质是制约经济效益的关键因子，因此，开展茶叶品质和树龄的关系以及微生物群落影响茶叶品质的机理方面的研究具有重要的意义。

土壤细菌群落复杂并且数量庞大，采用16S rRNA绝对定量的方法得到了相对和绝对丰度，相对丰度反映出单个样本中土壤中优势细菌群落，绝对丰度揭示了不同的样本之间的不同细菌群落动态变化趋势，通过绝对定量的方法可以更加准确的反映不同样本间的细菌群落结构。

4 结 论

16S rRNA绝对定量高通量测序表明，10yrs的土壤细菌群落多样性最高且高于林地，并随着树龄的增加而降低，茶树土壤和林地土壤细菌多样性表现为10yrs>0yrs>40yrs>80yrs>100yrs；植茶后土壤细菌总绝对丰度呈先增加后减小的趋势，表现为40yrs>80yrs>10yrs>100yrs，0和80yrs土壤细菌总丰度差异较小；植茶10年的茶园土壤细菌特有ASV最多，随着树龄的增加特有的ASV个数逐渐减小。Acidobacteria(酸杆菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Planctomycetes(浮霉菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Myxococcous(粘球菌门)、Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)是林地和茶园土壤细菌主要的优势门，绝对丰度占了整个细菌群落的76.30%～88.90%；高通量绝对定量的方法更有助于研究不同样本间微生物群落结构和变化趋势。