河蟹对水稻不同生育期根际土壤细菌群落结构的影响

宋 宇,杨清海,曲贵伟

(辽东学院，辽宁 丹东 118003)

【研究意义】根际是指距离植物根系几毫米宽的狭窄土壤区域，内含细菌、真菌、古生菌等种类众多的微生物及腐殖质等，植物根系分泌物可为根际微生物提供生长发育的营养物质；根际微生物能促进土壤中有机物质的分解,同时使土壤中的碳、氮、磷、硫等元素参与到农作物的物质循环中并能抑制或减轻作物病害、逆境危害等，从而促进农作物的生长发育和提高农作物的产量[1-2]。水稻是我国最重要的粮食作物，过去几十年中，由于引进高产品种、人为灌溉、大量使用化肥和农药，水稻产量有所增加[3-4]。但化肥和农药的过量使用会导致土壤酸化板结、温室气体排放增加、水体富养化等一系列生态环境问题[5-7]。如今，将农作物和动物生产有效结合的复合种养模式受到人们广泛关注。该模式不仅能提高养分循环效率而且能改善土壤生态环境[22]。研究表明，土壤微生物是维护稻田土壤生态系统的重要成员，水稻在不同生育期的生长过程实质是土壤—微生物—水稻相互作用的过程[8-9]。水稻及其根系的生长代谢活动可改变土壤理化性质，土壤性质又可影响水稻及其根系的生长代谢，两者的相互作用可调控土壤微生物群落结构和丰度的变化[10]。但河蟹对生物有机肥稻田不同生育期根际土壤微生物的群落结构影响的研究还属少见。【前人研究进展】土壤微生物群落结构研究已由最初的传统分离培养方法逐步发展到可高效、准确、快速获取大量土壤微生物信息的高通量测序法。随着高通量测序技术的发展，对常规种植的水稻的根际微生物群落的研究取得了一定进展[11]，目前已可全面分析菌群组成及群落结构的变化。【本研究切入点】本研究采用高通量测序技术开展河蟹引入生物有机肥稻田后对不同生育期水稻的根际土壤细菌群落多样性、丰度和群落结构影响的研究。【拟解决的关键问题】探讨河蟹引入生物有机肥稻田后不同生育期水稻的根际土壤细菌群落多样性指数、群落结构变化及门水平的优势类群、相对丰度及和土壤理化因子的冗余(RDA)分析，揭示水稻不同生育期土壤微生物动态变化及其影响因素，为探究复合种养模式水稻增产提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集和处理方法

本试验选取越光大米为试验材料，试验在丹东东港市北井子镇盖家坝农场进行，供试稻田为生物有机肥稻田和河蟹生物有机肥复合种养稻田，分别于水稻的分蘖期、拔节期、抽穗期和成熟期在稻田上随机选取5个点采用破坏性取样法将水稻整株挖出，勿伤害根系，抖落大块土壤后用无菌刷取根际区域约5 mm紧密粘附在根表面的土壤，每5株为1个重复，每个时期3次重复。混合后的样品分成2份，1份装入密封袋，带回风干处理，用于理化指标分析；1份装入50 mL离心管中，-80 ℃冷冻保存，用于微生物多样性分析。生物有机肥稻田的分蘖期、拔节期、抽穗期和成熟期分别用YJTFN、YJTBJ、YJTCHS和YJTCS表示，河蟹有机肥稻田的4个生长时期则分别用HXTFN、HXTBJ、HXTCHS和HXTCS表示。

1.2 土壤理化因子的测定

土壤pH值采用酸度计法测定；有机质测定采用重铬酸钾氧化—分光光度法；速效钾测定采用氯化钙浸提—火焰光度计法；速效磷测定采用碳酸氢钠浸提—钼锑抗比色法；全氮测定采用凯氏定氮法[12]。

两极化——中大型软件平台向行业化应用垂直深入，整合的功能和业务越来越丰富；中小型软件平台向轻量化应用演变，界面功能和交互操作越来越简捷。这两个看似矛盾的方向，根本上是为解决不同用户的需求，本质上都是依托先进强大的底层架构。

1.3 土壤微生物DNA提取、扩增及测序

利用FastDNA®Spin Kit for Soil试剂盒进行土壤微生物基因组DNA提取，提取的DNA经适当稀释后在-20 ℃条件下保存用于后续PCR扩增。用通用引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′扩增细菌16S rRNA基因的V3～V4区，并利用Illumina公司的Miseq PE300平台委托上海美吉生物对PCR扩增产物进行高通量测序。

1.4 数据处理

如表3所示，Shannon、Ace和Chao 3种α多样性指数分析显示生物有机肥田成熟期的Shannon和Chao指数均高于前3个时期且差异显著(P<0.05)。成熟期的Ace指数虽高于前3个时期但差异不显著(P>0.05)。河蟹引入生物有机肥田后，分蘖期的Shannon指数高于生物有机肥田的分蘖期且差异显著(P<0.05)，成熟期的Ace指数低于生物有机肥田的同一时期且差异显著(P<0.05)。拔节和抽穗期的Ace、Chao指数分别高于生物有机肥田的同一时期但差异不显著(P>0.05)。

2种稻田不同生育期的根际土壤通过高通量测序获得的序列可分为55个门，174个纲，397个目，624个科，1071个属，2292个种。将相对丰度<1%的菌门归为其它类，则所有样品中绿弯菌门(Chloroflexi，17.62%～28.44%)、放线菌门(Actinobacteriota，13.28%～25.53%)、变形菌门(Proteobacteria，12.35%～19.52%)、酸杆菌门(Acidobacteriota，9.28%～14.20%)在2种稻田不同生育期的根际土壤细菌群落中因占比最高而成为优势菌门。此外，样品中还有脱硫杆菌门(Desulfobacterota)、拟杆菌门(Bacteroidota)、厚壁菌门(Firmicutes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirota)、Myxococcota、芽单胞菌门(Gemmatimonadota)、MBNT15、髌骨菌门(Patescibacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobiota)等(图1)。在4种优势菌门中，生物有机肥稻田中放线菌门相对丰度值最高，河蟹引入生物有机肥稻田后，则绿弯菌门相对丰度值最高且在各时期的相对丰度值差异显著。放线菌门的相对丰度值随着水稻的生长发育逐步降低，成熟期最低，各个时期的相对丰度值差异显著。此外，酸杆菌门在河蟹有机肥稻田的各个生长时期的相对丰度值均高于生物有机肥稻田且差异显著。变形菌门在河蟹有机肥田的拔节期和抽穗期的相对丰度值都低于生物有机肥田，但到成熟期时则升至最高值但各个时期的相对丰度值差异不显著。

2 结果与分析

2.1 2种稻田不同生育期根际土壤理化性质

通过RDA分别对2种稻田细菌群落影响因素进行分析，生物有机肥细菌群落组成的主要影响因子是pH，河蟹引入生物有机肥田后，主要影响因子则为速效钾(AK，图4)。

表1 2种稻田不同生育期根际土壤理化因子

2.2 2种稻田不同生育时期土壤细菌群落高通量测序统计分析

高通量测序结果显示，本研究中生物有机肥田和河蟹生物有机肥田24个样品共获得849 065条有效序列。覆盖度均大于0.96接近1.00，说明测序达到一定深度，基本上能覆盖所有物种。以97%相似水平为划分依据，2种稻田各时期获得3177～4031个OUT(表2)。生物有机肥田成熟期的OTU数分别和分蘖期和拔节期差异显著(P<0.05)，河蟹进入生物有机肥田后，拔节和抽穗期的OTU数有所提升，但差异不显著(P>0.05)。

MiSeq 高通量测序所得到的原始数据(Raw Data)的双端序列数据经 Trimmomatic软件去杂和FLASH(1.2.11)软件拼接后再通过QIIME(1.9.1)软件进行质控和Usearch软件去除嵌合体序列即得到优质序列[13-16]。利用Uparse(version 7.1)软件按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行操作分类单元(OTU)聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。采用RDP classifier(version 2.1.1)贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类学水平上对比Silva(Release132数据库)统计各样本的群落物种组成。利用Mothur(1.30.2) 软件计算α多样性指数[17-19]，利用 SPSS 26.0 软件进行数据统计分析。利用CANOCO 4.5进行RDA冗余分析，以获取细菌群落结构与土壤理化性质的耦合关系。

表2 土壤细菌群落高通量测序信息统计分析