基于线粒体DNA和短串联重复序列技术的牛亲子鉴定

郭 帅，熊 琪，陶 虎，杨 娟，韩世昌

(1.湖北省农科院畜牧兽医研究所，武汉 430000；2.华中农业大学动物科技学院，武汉 430000)

【研究意义】我国是世界上牛品种最多的国家，共有53个地方品种和8个培育品种[1]。近年来，由于外来品种的引进，我国原有的地方品种资源在逐渐减少，对牛的品种筛选与繁育变得至关重要。牛的亲子鉴定是牛品种筛选的重要环节。【前人研究进展】微卫星标记就被认为是表征品种遗传多样性的首选标记[2]。Chaudhari等[3]利用25对荧光微卫星标记对Kenkatha和Gaolao这2个品种的牛进行了分子鉴定，证明这2个品种间几乎没有遗传分化。Acosta[4]利用30对微卫星标记评估了5个古巴牛品种的遗传多样性和关系，结果显示当地牛群中保持了大量的遗传变异。Novoa和Usaquén 等[5]检测了来自哥伦比亚的178只婆罗门牛的11个微卫星标记多态性，结果显示婆罗门牛的高度杂合性，揭示了品种起源。李芳玉[6]对云岭牛线粒体DNA全基因组遗传多样性研究发现，云岭牛是以云南地方黄牛为母本进行培育的肉牛品种，包括普通牛和瘤牛2个母系起源，且以瘤牛起源为主。李荣岭等[7]采用荧光标记引物扩增STR，通过全自动基因分析仪检测基因型，这种高通量检测方法准确、可靠，但检测费用昂贵。Ciampolinie 等[8]将1个由54头荷斯坦牛与4头意大利肉牛组成的测试组，用微卫星DNA测定，结果显示4头‘意大利牛’之间的遗传相似度较高，54头‘荷斯坦牛’间的遗传相似度低。吴伟等[9]利用4种微卫星标记对5个中外牛品种/群体遗传结构进行研究，发现西门塔尔牛自成一类，延边牛、韩牛为一类，南阳牛和杂种牛为一类。张自富等[10]利用微卫星标记技术研究了14个中外黄牛品种的遗传多样性，筛选出ILSTS005和ETH10 2个微卫星位点。【本研究切入点】亲子鉴定是通过分子生物学、分子遗传学和医学等技术手段，分析亲代和子代的遗传特性，从而判断是否具有亲缘关系[11-12]。亲子鉴定的遗传基础是孟德尔的遗传定律，包括基因分离和自由组合规律。在家畜的亲子鉴定中，通常使用排除法和似然法。排除法是利用各个位点的等位基因频率把不是亲生父亲的候选父亲排除的概率。似然法是通过建立候选父亲和子代的似然函数，在一定置信水平下为子代找到最似亲本[13]。【拟解决的关键问题】本研究中共有3头牛，通过Sry雄性特异性基因检测来证明这3头牛的性别，再根据终止法测序，比对mtDNA的D-loop区的位点突变情况，最后根据STR位点基因型来确定3头牛的亲子代关系。

1 材料与方法

1.1 样品

争议公牛C和嫌疑母牛A、B的外周血液样品。

1.2 试剂

基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖购自上海贝晶生物技术有限公司。

1.3 利用mtDNA D-loop区遗传标记进行牛母系血缘鉴定

采用Tris-饱和酚提取牛外周血液DNA。根据牛mtDNA的D-loop区设计引物(表1)，以牛外周血基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物经1.5%琼脂凝胶电泳回收纯化后，以双脱氧链终止法进行测序。Mutation Surveyor软件(v5.0.2)分析测序结果后，判断亲权关系。以牛 Sry 基因作为雄性特异性基因设计引物，并进行PCR扩增，用于性别鉴定。

PCR反应条件：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，共35个循环；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 保存，PCR扩增体系如表2所示。

1.4 利用微卫星遗传标记进行牛单亲亲权鉴定

采用Tris-饱和酚法提取牛尾静脉血DNA。选定的位点除了BM1824、BM2113、INRA023、ETH10、ETH225、SPS115、TGLA227、TGLA122这8个作牛的亲权鉴定必须包括在内的“国际标记组”外，参考贺建宁[14]的研究结果，增加了有丰富等位基因、高多态性特点的INRA037、INRA032、CSSM66、TGLA53和HAUT275个STR位点。合成13个STR位点，进行PCR扩增，并于AB 3130xl 遗传分析仪进行毛细管电泳分离、收集荧光信号、自动分析PCR 产物的长度，运用GeneMarker软件(v2.2.0)自动分析各等位基因的基因型。

2 结果与分析

2.1 线粒体D-loop区检测结果

牛A、牛B和牛C的线粒体D-loop区PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测表明，扩增产物约1000 bp，条带单一，无非特异性扩增条带(图1)。Sry雄性特异性基因检测结果(图1)显示，只有牛C的Sry雄性特异性基因可以形成扩增条带，表明牛A和牛B为雌性个体，与送检样品标注相符。

mtDNA的D-loop区PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收纯化后，用双脱氧链终止法测序，并进行序列比对。与参照序列(AY337535)相比，牛B、牛C的mtDNA D-loop区双脱氧链终止法测序结果共检测到47个突变，牛A共检测到46个突变(表3)，其中牛B mtDNA D-loop区的47个位点与牛C突变方式完全一致，而牛A的291A>G这个位点与参照序列(AY337535)相同，不同于牛C。以上mtDNA D-loop区测序分析结果表明，牛B与牛C是来源于同一母系的个体。

表1 牛mtDNA的D-loop区鉴定使用的引物

表2 PCR扩增体系

图1 牛A、牛 B和牛C的mtDNA D-loop区及Sry基因PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoresis of mtDNA D-loop region and Sry gene PCR products of cow A,cow B and cow C

表3 被鉴定对象mtDNA D-loop区测序结果与参照序列(AY337535)的比对情况

表4 13个位点等位基因的基因型

2.2 微卫星标记检测结果

13个STR位点的PCR产物均有条带(图2)。3件送检样本的BM1824、BM2113、INRA023、ETH10、ETH225、INRA037、INRA032、CSSM66、SPS115、TGLA53、TGLA227、TGLA122、HAUT27基因座中均检出基因型(即等位基因片段后者大于前者)。利用AB 3130xl 遗传分析仪对13个位点的扩增产物进行毛细管电泳分离。牛B和牛C的BM1824位点符合孟德尔遗传规律(图3)，而牛A与牛C在这个位点不符合(因为牛B基因型片段小于等于牛C，牛A基因型片段比牛C大)。牛B和牛C在13个STR位点的基因型全部符合孟德尔遗传规律(表4)，牛A和牛C在1号染色体的BM1824位点、2号染色体的BM2113位点、3号染色体的INRA023位点、10号染色体的INRA037位点、11号染色体的INRA032位点、16号染色体的TGLA53位点和26号染色体的HAUT27位点不符合孟德尔遗传规律。

图2 牛A、牛 B和牛C的1～13个微卫星标记PCR产物电泳图Fig.2 Electrophoresis of PCR products of 1-13 microsatellite markers in cow A,cow B and cow C

3 讨 论

mtDNA(mitochondrial DNA)又称线粒体DNA，是重要的遗传标记，是细胞中唯一的核外基因组DNA[15]。线粒体以母系遗传方式遗传，不受染色体重组的影响，可弥补微卫星因发生重组影响基因频率和基因型频率，最终导致鉴定率降低的不足。同时，线粒体拷贝数多，每个细胞含有10～1000个线粒体，多数线粒体内含有多拷贝的mtDNA，因此对mtDNA的检测比核基因组DNA(nDNA)的灵敏性高，具有更高的检出率[16]。但是线粒体DNA存在结构多样性，且单独使用线粒体DNA测序技术作为分子标记存在一定的缺陷[17]。

根据本次送检样品的检测结果，基本可以排除牛A与牛C具有亲子关系的可能性。鉴于牛B和牛C的 mtDNA D-loop区47个位点的突变方式完全相同，该方法检测结果只能说明牛B与牛C有母系血缘关系，其亲子关系还必须通过常染色体STR来确定。

STR本研究共选定为位点除了BM1824、BM2113、INRA023、ETH10、ETH225、SPS115、TGLA227、TGLA122这8 个作牛的亲权鉴定必须包括在内的“国际标记组”外，还增加了INRA037、INRA032、CSSM66、TGLA53和HAUT27这5个STR位点。其中INRA037位点等位基因数为14，多肽信息含量为0.671；INRA032等位基因为8，多肽信息含量为0.537；CSSM66等位基因数为11，多肽信息含量为0.734；TGLA53等位基因数为18，多肽信息含量为0.881；HAUT27等位基因数为11，多肽信息含量为0.737。王均辉等[18]研究发现，秦川牛的平均多肽信息含量为0.7686，平均杂合度为0.7959。王敏强等[19]研究发现，鲁西黄牛平均多肽信息含量为0.797，平均杂合度为0.820；渤海黑牛的平均多肽信息含量为0.798，平均杂合度为0.821；秦川牛的平均多肽信息含量为0.795，平均杂合度为0.819。遗传连锁分析显示，多肽信息含量大于0.7的微卫星位点为最理想的选择标记，所以本实验中13个STR可以作为进一步连锁分析的候选遗传标记和个体鉴定。母牛B和公牛C在13个STR基因座均符合孟德尔遗传规律[12]，相对亲权概率(RCP)为99.99%，母牛B是公牛C的生物学母本的几率大于99.99%；母牛A和公牛C之间有7个STR基因座不符合孟德尔遗传规律，因此，排除母牛A与公牛C具有亲子关系的可能性。

图3 1号染色体BM1824位点毛细管电泳结果Fig.3 Results of capillary electrophoresis at bm1824 site on chromosome 1

吴继法等[20]在研究中选用了36个STR位点，采用荧光多重PCR，对凉山半细毛羊进行亲子鉴定，得到的累积非父概率为99.999 999%。贾名威等[21]研究显示，采用6个STR位点，得到奶牛的累积非父排除率98.827%，肉牛累积非父排除率99.578。其结果低于国内外亲子鉴定的标准。本研究所检测的13个基因座既可以达到国内外亲子鉴定的精确度要求，又做到实验操作简便，成本较低，更加适应生产实际。这13个基因座具有高遗传多态性，在同一模板浓度下，各位点PCR扩增产物经过遗传分析仪分析，得到的检测峰信号较强且峰型好。本研究采用的STR复合扩增[22]、荧光标记、毛细管电泳检测[23]、GeneMarker软件[24]分析的方法优点较多，比如高分辨率、高准确度、速度快等，表明这种方法在动物遗传研究中有很强的实用性[25]。

4 结 论

根据mtDNA D-loop基因分型结果，确定牛B与牛C具有母系血缘关系，排除牛A与牛C存在母系血缘关系。根据DNA遗传标记分型结果，确定牛B是牛C的生物学母亲；排除牛A是牛C的生物学母亲，说明该方法用于牛亲子鉴定具有可靠性。