煤矸石对褶纹冠蚌斧足和外套膜重金属含量及组织结构的影响

周 瑶，刘丽丹，孙庆业

(安徽大学资源与环境工程学院，合肥 230601)

【研究意义】近年来，随着经济快速发展和人类活动的加剧，微量元素(包括重金属)通过雨水淋溶、自然风化等途径进入环境介质，导致微量元素污染日益严重[1]。重金属无法被环境中的微生物降解，却可以通过食物链在其他生物体内富集，形成生物放大效应[2]。进入环境中的微量元素不仅导致其在生物体内积累，还会对生物体组织结构造成破坏[3]；同时，微量元素通过食物链进入人体，对人体健康造成严重危害[4]。煤矸石是采煤和洗煤过程中产生的固体废物[5]，露天堆放不仅占用土地资源，在雨水的冲刷和浸泡下，煤矸石中被风化的微量元素还会进入周边土壤环境造成污染[6]，进而随地表径流进入水体，并通过离子交换、吸附、络合、絮凝、共沉淀等作用，最终绝大部分进入河床表层沉积物中[7]，从而对底栖生物造成巨大威胁。【前人研究进展】目前，国内外已有很多关于蚌体内重金属积累的报道。Lukashev[8]发现，与未受污染河流相比，生活于受生活废水污染河流中的鸭嘴无齿蚌(Anodontaanatina)各组织中Cu和Zn的含量均较高；孙磊等[9]在以野生背角无齿蚌为对象进行太湖重金属淡水贝类研究时发现背角无齿蚌可用于检测淡水中持久性污染物的生物积累；翁焕新等[10]研究表明，重金属在牡蛎(Crassostreavirginica)中的生物积累是牡蛎自身的新陈代谢以及环境等诸多因素综合影响的结果。【本研究切入点】褶纹冠蚌(Cristariaplicata)为软体动物门(Mollusca)双壳纲蚌科的软体动物，广泛分布于我国多个省区，在安徽省两淮采煤沉陷区水体中亦有分布。由于褶纹冠蚌具有高滤水速率以及较强的重金属富集能力，因此常被用来进行重金属污染生物监测研究[11]。沉积物是水体中重金属等污染物的重要汇聚地[12]，褶纹冠蚌营底栖生活，作为水生生态系统食物链的初级消费者，不仅是初级生产者的滤食者，也是高级消费者的食物来源，是重金属污染的首要受害者[13]。重金属在蚌体内会与巯基蛋白结合，改变蛋白质构象，对蚌的组织结构有较大的危害[14-15]。【拟解决的关键问题】本研究以褶纹冠蚌为研究对象，通过模拟自然环境进行水池养殖实验，探讨煤矸石对褶纹冠蚌斧足和外套膜中微量元素含量及组织结构的影响。

1 材料与方法

1.1 实验设计

养殖试验在安徽大学(磬苑校区)的养殖池(每个养殖池的容积为9×103L)内进行。模拟采煤沉陷区环境，各养殖池内平铺20 cm的风干土壤，浸泡，待土壤软化后，静置1周，放水至1 m深，投放铜锈环棱螺、圆顶珠蚌等水生动物，马来眼子菜(Potamogetonmalaianus)、苦草(Vallisineriaspiralis) 等水生植物，构造简单的水生系统。待池内生物稳定后(约30 d)，将风干后的煤矸石(采自谢桥煤矿)按照重量梯度0 kg(A池)、60 kg(B池)、140 kg(C池)称重并装入网兜，于2019年9月分别投入3个养殖池中，并分别投入25只大小相似的褶纹冠蚌。投入煤矸石梯度的设定是基于前期对谢桥煤矿采煤沉陷区的实地调查，以沉陷区塌陷面积、塌陷深度以及岸边弃置煤矸石量为根据。所投放的褶纹冠蚌采自安徽省巢湖同一区域，投放之前先在室内用清洁的自来水暂养1周。

1.2 样品采集及预处理

养殖池内的沉积物样本于2019年9月(褶纹冠蚌投放之前)和2020年9月(采集褶纹冠蚌样品时)分别采集1次，各养殖池均采集3个平行。现场用塑料锹挖取200 g沉积物装于洁净的聚乙烯封口袋内，并立即放入存有冰袋的约4 ℃保温箱内保存。带回实验室后，样品先经真空冷冻干燥，然后用玛瑙研钵研磨，过尼龙筛，用于化学性质的分析。

每个养殖池各采集10～15只褶纹冠蚌样本装入桶内，带回实验室后用自来水清洗除去蚌壳表面泥土。清洗后的褶纹冠蚌用塑料刀具剖开蚌壳，分别获取外套膜和斧足。将取得的外套膜和斧足一部分保存于装有4%中性缓冲多聚甲醛固定液中固定，用于切片制作；剩余部分装于洁净的聚乙烯封口袋内，经真空冷冻干燥、玛瑙研钵磨碎后，用于微量元素测定。

1.3 沉积物常规指标测定

氨氮的测定方法采用苯酚—次氯酸钠分光光度法；pH检测使用pH计(pHS-3C)[m(土)∶m(水)=1 ∶5][16]；总氮采用高氯酸—硫酸消化法处理后，使用凯氏定氮仪测定[17]；总磷采用钼锑抗分光光度法(Standard Measurement and Test，SMT)测定[18]；有机质采用烧失量法测定[19]；为了保证分析结果的准确性，每个样品做3个平行样，并且保证平行分析误差<5%，最终取平行样的平均值进行分析。

1.4 微量元素含量分析

1.4.1 养殖池沉积物微量元素检测 养殖池沉积物中Cu、Zn、As、Pb、Cd含量采用HCl-HNO3-HF-HClO4消解[20]，电感耦合等离子体质谱仪[17](ICAPQ，Thermo Fisher，美国)测定，以国家土壤和标准物质(GSS-9 和 GSS-26)进行质量控制，各元素加标回收率在 91%～105%，为提高精确度和减小随机误差，所有样品分析均重复3次(取其平均值)。

1.4.2 斧足和外套膜微量元素检测 置样品于聚四氟乙烯消解罐中，加入6 mL浓硝酸和2 mL 30%过氧化氢，加盖静置1 h后置于120 ℃电热板上进行消解，消解后的样品用电感耦合等离子体质谱仪(ICAPQ，Thermo Fisher，美国)测定，插入扇贝生物成分分析标准物质[GBW10024(GSB-15)]进行质量控制，各元素加标回收率在90%～110%，为了提高结果的精确度和随机误差，所测生物样品均设置3组平行，取其平均值进行分析。

1.5 斧足和外套膜组织切片制作

取固定后的斧足和外套膜生物组织进行洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋操作，采用石蜡切片技术进行切片，于光学显微镜下观察、拍照。

1.6 数据处理

运用Excel 2016对数据进行初步整理以及计算，方差分析用 SPSS 21.0 软件进行。

2 结果与分析

2.1 养殖池沉积物的理化性质

从表1可知，2020年9月，试验池内沉积物中总氮、总磷和有机质含量均有所增加，试验组沉积物pH值略有升高。

从表2可以看出，投加煤矸石并未对养殖池中沉积物的Cu、Cd含量产生影响，但随着煤矸石投加量的增加，沉积物中Zn、As和Pb含量逐渐增加，土壤中微量元素的含量表现为Zn>As>Pb>Cu>Cd。

2.2 褶纹冠蚌不同组织重金属含量

贝类对重金属具有较强的富集能力。斧足是斧足纲生物进行运动的组织，斧足受损可直接导致贝类死亡；外套膜也称鳃腔，通常排泄孔、生殖孔和肛门都开口于外套腔，有便于水流进出，辅助摄食、呼吸、生殖、运动等功能，在褶纹冠蚌的生命中占有重要地位。从表3可以看出，斧足和外套膜中5种微量元素含量均表现为C>B>A，表明斧足和外套膜中5种微量元素含量随着养殖池中投加的煤矸石数量的增加而增加，其中煤矸石投加量为140 kg(C池)时，斧足和外套膜中5种微量元素含量与对照组(A池)均有显著差异。煤矸石投加量为60 kg(B池)时，斧足中Zn、Pb和Cd含量与对照组(A池)存在差异；外套膜中的Cd含量也显著高于A池。说明，煤矸石的加入可导致褶纹冠蚌外套膜和斧足中微量元素含量增加。

本研究中，无论是斧足还是外套膜，5种微量元素的含量均表现为Zn>As>Cu>Pb>Cd，斧足和外套膜中Zn、As和Cd含量变化和沉积物一致。表明褶纹冠蚌组织中不同元素含量的差异主要受外界环境影响。

表1 养殖池沉积物理化指标质量浓度

表2 养殖池沉积物重金属含量

表3 褶纹冠蚌不同组织中微量元素含量

图1 褶纹冠蚌斧足组织切片Fig.1 Tissue section of axe-foot of Cristaria plicata

MF:肌纤维;IE:内表皮;OE:外表皮;BR:空白区域;BV:血管;Ec:上皮细胞;Va:空泡;CM:环形肌肉层;Cb:细胞核MF：Myofiber;IE:Endocuticle；BR:Blank area；BV:Blood vessel；Ec:Epithelial cell；Va：Vacuole；CM：Annular muscle layer；Cb:Cell nucleus图2 褶纹冠蚌外套膜组织切片Fig.2 Section of mantle tissue of Cristaria plicata

本研究中，外套膜中5种微量元素含量均高于斧足。说明褶纹冠蚌的不同组织对进入体内的重金属的积累量明显不同。

2.3 褶纹冠蚌不同组织结构变化

2020年9月，B池和C池中部分蚌体内有粘液排出，两瓣壳微微张开，捏动双壳时有略微松动；解剖过程中观察到，部分蚌体内的内脏团颜色呈浅褐色，斧足略微肿胀，鳃由健康的淡黄色变为暗黄色。说明煤矸石的投加已经对褶纹冠蚌生命活动产生了影响，这可能与煤矸石中某些污染物质释放到试验水体有关。

对照组斧足的表皮细胞呈柱状，顶端有许多排列整齐的纤毛，形成了略有规则的褶皱(图1)。B组表皮下组织层变薄，肌束间间距变大，与对照组相比没有显著变化。与对照组相比，C组斧足表皮形成了较不规则的褶皱，表皮下细胞核染色变浅，可能是细胞减少导致；肌束松散不规则，空泡现象明显，并且表皮下肌纤维断裂明显，排列混乱。由此可见，煤矸石投加量越大，褶纹冠蚌斧足病理损伤程度越大。

对照组褶纹冠蚌表皮有规则的褶皱(图2)，表皮下方细胞核染色深，细胞联系紧密且排列规则，肌纤维细长，肌肉层在边缘膜两侧厚度不一，组织间有许多空泡。B组褶纹冠蚌上皮褶皱趋于平直，肌纤维排列不规则，少量结缔组织断裂形成空白区域；C组褶纹冠蚌肌纤维断裂明显且排列混乱，肌纤维较短，组织间空泡变少，内表皮细胞核排列不规则，有的破裂脱落。

B、C池中的褶纹冠蚌组织间损伤程度均表现为外套膜大于斧足，结合前述2.2中得到的结论：外套膜中5种微量元素含量均高于斧足，表明组织中Cu、Zn、As、Pb、Cd的积累可能是导致斧足和外套膜出现组织病变的因素之一。

3 讨 论

3.1 沉积物理化性质和重金属变化

采集褶纹冠蚌样品时，发现养殖池的沉积物中有少量蚌、螺和植物的残骸，水生生物死亡残骸的累积会导致沉积物中的有机质、总氮、总磷含量升高[21]；另外投加到养殖池中的煤矸石也含有有机质及含氮和磷的化合物，煤矸石中这些物质的释放也会导致沉积物中有机质、总氮和总磷增加。在煤矸石长期堆积的过程中，经过长期的氧化、降雨的洗刷以及微生物对各种矿物的分解和溶解作用，使难溶于水的矿物质变成较易被土质吸收的有机质、氮、磷等营养元素，增加了其在土壤中的含量[22-23]。培养时间到达1年时，试验组沉积物pH略有升高，这可能与煤矸石偏碱性有关[24]。

自然环境中，沉积物中微量元素含量变化与多种因素有关。暴露于空气中的煤矸石在自然风化过程中逐渐向周边环境释放微量元素，所释放的微量元素数量和速率首先受煤矸石自身微量元素含量、微量元素在煤矸石中的赋存形态的影响，释放微量元素的多少也直接影响微量元素进入沉积物中的数量。微量元素在煤矸石中的赋存形态决定其从煤矸石中淋溶析出的难易，相同条件下，以有机态存在的微量元素在淋溶时较难析出，而以无机态存在特别是以吸附态存在的微量元素在煤矸石淋溶时，易从煤矸石中析出[25]。煤矸石中微量元素含量越高，其释放到周边环境中的潜在数量也就越多；含有微量赋存矿物越容易风化，则释放速率越快。大部分微量元素在浸泡前期的浸出浓度受煤矸石风化程度的影响，Zn元素在整个浸泡过程的浸出浓度均受到煤矸石风化程度的影响，而部分元素无此规律[26]。另外，煤矸石在自然风化过程中还受到外界环境(如pH、温度、湿度等)的影响，研究发现煤矸石中重金属As、Pb在弱酸性浸泡液中更易被融出释放；多数微量元素在浸泡前期和中期的浸出浓度均与煤矸石粒径大小有关[26]。煤矸石中往往含有较多的Zn、As、Pb等重金属元素[27]，这也决定了释放到环境中各微量元素含量的差异。孙亚乔等[28]发现堆放场土壤重金属Zn、As、Pb的均值皆超过远离堆放场土壤背景值和中国土壤背景值，煤矸石堆置场周边土壤中As污染最严重[27]，Zn含量也显著超过周边及中国土壤背景值[28]，这些现象说明了煤矸石量的多少往往也决定了周边环境中微量元素数量的多少。遭受重金属污染的土壤中，目前主要围绕土壤重金属赋存形态[29]、土壤污染评价和重金属的释放迁移等展开，针对煤矸石释放重金属化学行为鲜有报道，本研究中Cu、Cd在沉积物中的含量没有显著变化可能与pH、电导率、温度等诸多因素的联合作用有关。

3.2 褶纹冠蚌不同组织重金属含量变化

水生生物尤其是贝类对重金属具有较强的富集能力[30]。陈修报等[31]在研究3种不同污染生境背景中背角无齿蚌的重金属积累特征时，发现重金属污染较为严重的生境背景中的背角无齿蚌体内重金属含量也相应较高；贝类生活的环境因子影响贝类对重金属的吸收，表现为贝类体内的Zn、Cu含量与海水中这2种微量元素浓度呈正相关，与盐度呈负相关，而与水温、pH、溶解氧没有相关性[32]；相关研究表明，贝类体内重金属含量呈现一定季节分布特征[33-34]。

重金属进入蚌体内后，不同组织对它们的积累具有较为明显的选择性[31]。本研究中，外套膜中5种微量元素含量均高于斧足，吴曼曼等[13]在研究巢湖4种蚌类不同组织中5种微量元素含量及其空间变化中得到相似结论。不同组织中微量元素含量差异可能是由于不同组织对微量元素的吸收机制不同造成的，赵卫红等[35]在研究滩涂贝类不同组织器官对重金属的富集能力时发现，部分重金属在贝类内脏囊和食道腺中的含量远高于其他组织器官，另外发现Pb在足中的含量是食道腺中的3.8倍，由此推断不同重金属进入贝类不同组织的主要方式不同，可能主要是进食或渗透作用；许澄源等[36]发现贻贝各部位As含量顺序分别为内脏团>生殖腺，鳃>体液，表明贻贝对As的累积途径可能主要通过食物进入体内，鳃和生殖腺的体表吸附是次要的。

3.3 褶纹冠蚌不同组织结构变化

本研究中，投加煤矸石的养殖池B池和C池褶纹冠蚌的斧足组织形态结构均出现了与正常情况不同程度的差别，主要表现为肌纤维断裂、肌束松散不规则。而在正常情况下，斧足纵切面主要由肌肉组织构成，表面覆盖1层由柱状细胞组成的表皮，并形成许多褶皱，表皮下面有1层较薄的环肌，中央都是由纵横交错的肌束组成，形成三维的网状结构，由结缔组织相互连接，具有丰富的血管[37]，说明煤矸石的投加对斧足组织产生了影响。涂叶绿等[38]研究了铜、镉联合胁迫处理对鲫鱼肌肉的影响，发现肌肉组织中的肌纤维断裂、聚集、崩溃、溶解，同时肌纤维间隙增大，且重金属浓度越高，病理损伤越大。邵健忠等[39]在研究三角帆蚌瘟病的组织病理时，发现病蚌也有蚌壳微微张开，斧足肿大变黄等体征，与本研究在采集褶纹冠蚌样本时观察到的现象极为相似。由此猜测，重金属威胁可能会导致褶纹冠蚌病变，进而导致组织结构产生变化，有待进一步研究。

外套膜的内表皮直接与水接触，外套膜在贝类的摄食、排出进入外套腔的异物及防御等方面都有非常重要的作用，破坏外套膜会降低贝类防御功能[40]。本研究中，投加煤矸石的养殖池B池和C池褶纹冠蚌的外套膜组织形态结构均出现了与正常情况不同程度的差别，主要表现为肌纤维断裂、结缔组织之间形成空白区域。而健康蚌的外套膜由内外上皮层、结缔组织、肌纤维及一定数量的粘液分泌细胞组成，上皮细胞排列整齐，结缔组织均匀分布[41]，细胞联系紧密，组织中间是疏松的连接组织，中间有多个空泡。蚌在受到不同外界刺激条件下，其内脏团、鳃、外套膜等是主要受损组织[42]。镉极易通过钙道穿过细胞膜进入组织细胞[43]，导致人和动物组织器官形态变化和结构损伤[44-45]。本研究中，随着煤矸石/水比率的增加，褶纹冠蚌外套膜组织中的各微量元素含量随之增加，外套膜组织损伤程度也随之加深，说明煤矸石/水比率是影响褶纹冠蚌外套膜组织形态结构受损程度的因素。

褶纹冠蚌组织结构发生变化的原因很多。煤矸石中除重金属元素污染物之外，还有多环芳烃等持久性有机污染物，也可能导致水生动物组织器官病变，此外，有害元素在组织中的积累还可能引起蚌体对环境中的病原微生物的抵抗力下降，导致其感染相关病毒或病原菌，从而造成组织器官形态结构的变化。Hawkins等[46]报道低浓度的多环芳烃能够引发青鳉鱼肝脏肿瘤；混有PAHs的海洋沉积物可以导致伤寒沙门氏菌株突变[47]。陈志胜等[48]发现杂色鲍(Haliotisdiversicolor)患溃疡病后斧足出现了上皮细胞肿胀并逐渐脱落，肌纤维萎缩变细，染色变浅，排列杂乱无章，严重时肌纤维断裂形成空洞等症状。任素莲等[49]发现海湾扇贝(Argopectensirridians) 感染球形病毒后其外套膜也有类似变化。本研究中，微量元素之外的其他因素导致的褶纹冠蚌组织学变化仍待进一步探讨。

4 结 论

(1)外套膜对微量元素的富集能力大于斧足；褶纹冠蚌斧足和外套膜中Cu、Zn、As、Pb的质量分数随煤矸石/水比率的增加而显著增加(P<0.05)；不同重金属元素在褶纹冠蚌的斧足和外套膜组织中的质量分数从大到小的顺序均为Zn、As、Cu、Pb、Cd。

(2)煤矸石释放微量元素对褶纹冠蚌的斧足和外套膜组织均产生了不同程度的影响，同种污染条件下，外套膜受损程度大于斧足；斧足组织中，表皮褶皱变得无规则，表皮下细胞核染色变浅，肌纤维断裂明显，肌束间间距增大。外套膜组织中，上皮褶皱趋于平直，内表皮细胞核排列规则且染色变浅，肌纤维排列混乱且有断裂现象，组织间空泡减少。随煤矸石/水比率增大，2种组织的病变程度加深。