植物水提液和拮抗菌对香蕉枯萎病及土壤微生物的影响

漆艳香，张 欣，彭 军，谢艺贤

(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南 海口 571101)

植物水提液和拮抗菌对香蕉枯萎病及土壤微生物的影响

漆艳香，张 欣，彭 军，谢艺贤*

(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南 海口 571101)

【目的】 探讨2种菊科植物全株水提液和2株拮抗菌对香蕉枯萎病及土壤微生物的影响，为香蕉枯萎病的防治措施提供参考依据。【方法】采用盆栽试验法测定了向日葵(Helianthusannuus)、油麦菜(Lactucasativavar.longifoliafLam.)根茎叶水提液及洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia, TY)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens, DF)对香蕉枯萎病的防效及土壤中香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.cubenserace4, Foc4)、普通真菌、细菌和放线菌的数量变化。【结果】向日葵、油麦菜、TY和DF处理均能降低香蕉枯萎病病情指数、减轻植株的受害程度，有一定的防病效果，其中向日葵、油麦菜处理防病效果较好(分别为39.02 %和34.18 %)。与对照(CK)相比，4种处理均能显著提高土壤中细菌数量，减少放线菌、Foc4和普通真菌数量，且均达显著性水平。相关性分析发现，防病效果与土壤中Foc4及普通真菌呈显著正相关，与细菌及放线菌则呈显著负相关。【结论】向日葵、油麦菜全株水提液及拮抗菌TY和DF均有利于改善土壤微生物结构，减轻和延缓香蕉枯萎病的发生为害，其中向日葵、油麦菜全株水提液对香蕉枯萎病的防控作用及土壤微生物的影响相对明显。

向日葵；油麦菜；洋葱伯克霍尔德氏菌；解淀粉芽孢杆菌；香蕉枯萎病；防病效果

【研究意义】由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf. sp.cubense, Foc)引起的香蕉枯萎病是一种毁灭性的土传病害，化学防治、农业防治均难以从根本上解决该病的危害，而且还存在防治成本高、环境污染严重、生态负面影响大等缺点，是我国传统香蕉产区种植面积逐步萎缩的主因[1]。种植抗枯萎病香蕉品种被认为是解决这一关键问题的最有效的措施，但目前我国主栽香蕉品种均不抗病,一些新引进或自选的抗枯萎病香蕉新品种在产量和商品性方面与当家品种巴西蕉还有较大的差距，直接影响蕉农和销费者的接受程度，造成抗病新品种的推广应用工作较被动[2]。【前人研究进展】生物防治被认为是目前较安全的防治措施，符合耕地质量提升及有机食品发展要求[3-5]。研究发现，菊科植物含有大量抗菌物质，对病原菌具有较强的抑菌活性[6-9]。菊科植物向日葵(Helianthusannuus)及油麦菜(Lactucasativavar.longifoliafLam.)根茎叶、茎叶与根部水提液对香蕉枯萎病菌孢子和菌丝有较强的抑制作用[10]。本实验室分离保存的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia，TY)能降解几丁质和镰刀菌酸、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens，DF)能降解几丁质，2个菌株对香蕉枯萎病菌均有较强的抑制作用，且在盆栽与田间初步试验中也有较好防效[11]。【本研究切入点】目前关于向日葵、油麦菜、几丁质或镰刀菌酸降解菌对土壤微生物的影响及其与防病之间的相关性研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究通过盆栽试验，探讨向日葵、油麦菜全株水提液和拮抗菌TY和DF对香蕉枯萎病的防病效果及土壤微生物的影响，以期为香蕉枯萎病的大田综合防治措施提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试香蕉品种为巴西蕉(MusaAAA Cavendish cv. Brazil)，杯苗由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带果树病害课题组提供。香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusariumoxysporumf. sp.cubenserace 4，Foc4)由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带果树病害课题组提供。向日葵Helianthusannuus为TK929和油麦菜Lactucasativavar.longifoliafLam.为抗热无斑油麦208，均采自海南省澄迈县福山镇红光农场。洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia, TY)能降解几丁质和镰刀菌酸，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens, DF)能降解几丁质，均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带果树病害课题组提供。健康砖红壤采自中国热带农业科学院海口院区，其主要理化性质为酸碱度(pH)4.4，有机质含量58.0 %，碱解氮(N)52.5 mg · kg-1，速效磷(P)3.3 mg · kg-1，速效钾(K)47.0 mg · kg-1。

1.2 试验方法

1.2.1 Foc4孢子悬浮液制备 取培养好的菌丝块，分多点接种到PDA培养基平板上，置于28 ℃恒温培养箱中约7 d，菌丝长满全皿，将少许无菌水倒入培养皿中，用灭菌毛笔轻轻刷洗培养基表面，获得Foc4孢子悬浮液，用灭菌水制成1×106个·mL-1的分生孢子悬浮液。

1.2.2 拮抗菌液制备 将拮抗菌TY和DF活化培养后，分别挑取单菌落接种于LB培养液中，28 ℃、150 r/min 摇床振荡培养24 h，用无菌LB液稀释配制成浓度约为1×106CFU · mL-1的菌体悬浮液。

1.2.3 植物水提液制备 采集向日葵及油麦菜新鲜根茎叶，分别用去离子冲洗干净，沥干表面水份并切碎，称取100 g加入200 mL无菌水，常温下搅拌机搅碎成匀浆，离心，取上清并经0.22 μm滤膜过滤，获得质量浓度为500 mg · mL-1水提液。

1.2.4 试验设计 盆栽试验于温室内进行，设6个处理：S1．接种Foc4，浇灌500 mg · mL-1油麦菜根茎叶水提液；S2．接种Foc4，浇灌500 mg · mL-1向日葵根茎叶水提液；S3．接种Foc4，浇灌1×106CFU · min-1拮抗菌液TY；S4．接种Foc4，浇灌1×106CFU · min-1拮抗菌液DF；S5．CK(接种Foc4，浇灌无菌水)。每个处理设3个重复，每个重复3盆，每盆种植1株香蕉苗。每个塑料盆(14 cm×15 cm)装2 kg土，将3～4叶期巴西蕉种植于盆中，淋足定根水，置于自然光照条件下培养。保持盆内土壤湿润，待香蕉苗有6～7片叶，高约10 cm左右时，采用伤根浇灌法接种，每盆接入Foc4孢子悬浮液100 mL(1×106个min-1)，2 d后再向各处理盆内浇灌200 mL相应浓度的处理液，对照以清水代替。

1.2.5 试验管理与取样 试验期间，各处理盆栽管理措施一致。浇灌处理液后第1、2、4、6、8周取环根际土样，共取5次。采样深度约为10 cm，最后1次取样的同时观察蕉苗发病情况，记录发病症状。

1.2.6 土壤微生物测定 采用稀释平板计数法测定土壤中细菌、真菌、放细菌、香蕉枯萎病菌(Foc4)数量，细菌培养采用牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌培养采用高氏1号培养基，真菌培养采用马丁-孟加拉红链霉素琼脂培养基，Foc4培养采用韩宝坤等提出的培养基和方法[12]。

图1 不同处理对香蕉枯萎病病情指数及防病效果的影响Fig.1 Effects of different treatments on banana fusarium wilt disease index and disease-control (8 weeks after treatment)

1.2.7 病情指数与防病效果 香蕉枯萎病病情统计方法参考文献[13]的方法进行，并计算病情指数及病情抑制率。病情指数=[∑(病情级别×该病情级别的植株数)/ (病情最高级值×处理植株总数)]×100，防病效果=[(对照病情指数-处理病情指数)/ 对照病情指数]×100 %。

1.3 数据分析

所有数据均采用 Excel 2007 和 DPS数据处理系统处理，采用Duncan’s分析对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 植物水提物及拮抗菌对香蕉枯萎病的防病效果

从图1可以看出，处理8周后，S5处理(CK)的植株病情指数最高，S1～S4处理病情均显著低于CK，说明浇灌植物根茎叶水提液及拮抗菌液对香蕉枯萎病有一定的防效。其中S1(油麦菜水提液)的病情指数最低，防效为38.02 %，其次为S2(向日葵水提液)，防效为34.18 %，S3～S4处理的病指较高，防效均较差。

2.2 植物全株水提物及拮抗菌对土壤微生物的影响

图2 不同处理对土壤中香蕉枯萎病菌数量的影响Fig.2 Effects of different treatments on Foc4 population in the soil

2.2.1 香蕉枯萎病菌(Foc4)数量 由图2可以看出，相对于CK，4个处理都不同程度地降低了土壤中Foc4数量，且与CK 的差异均达到显著水平。在整个试验期间，S1处理土壤中Foc4数量最低，处理8周后，仅为7.12×103CFU · g-1，其次是S2，为8.92×103CFU · g-1，二者间虽无显著差异，但均显著低于其它处理，各处理Foc4数量为S5>S4>S3>S2>S1。

此外，同一处理在不同处理时间内土壤中Foc4也有所不同，但变化趋势相似。处理后1～4周，Foc4数量整体呈上升趋势，以S5(CK)上升最为显著，从243.00×103CFU · g-1增长到763.00×103CFU · g-1。S2处理从第1周时的8.82×103CFU · g-1增长到第4周时的15.95×103CFU · g-1，增长幅度仅为CK的66 %，增长最为缓慢。处理后4～8周，各处理Foc4数量整体表现为下降趋势，其中4～6周下降显著，6～8周期间趋于平缓。

2.2.2 可培养真菌数量 由图3看出，在整个试验期间，4个处理土壤中真菌数量均低于CK，不同处理与 CK 之间真菌数量的差异均达到显著水平。整个试验期间S1处理土壤中真菌数量最低，处理8周后，真菌数量为41.00×105CFU · g-1，其次是S2，真菌数量为47.90×105CFU · g-1，分别比CK减少了36.63 %和24.80 %，各处理真菌数量为S5>S4>S3>S2>S1。

图3 不同处理对土壤中真菌数量的影响Fig.3 Effects of different treatments on fungus population in the soil

图4 不同处理对土壤中细菌数量的比较Fig.4 Effects of different treatments on bacterium population in the soil

此外，处理后1～4周，真菌数量整体呈上升趋势，4～6周时，各处理真菌数量整体表现为下降趋势，6～8期间周趋于平缓，这与Foc4数量变化趋势相似。

2.2.3 可培养细菌的数量 由图4可以看出，在整个试验期间，4个处理土壤中细菌数量都高于CK，且不同处理与 CK 之间细菌数量的差异均达到显著水平。整个试验期间S1处理土壤中细菌数量最高，并于第4周时达到最大值385.90×107CFU · g-1，显著高于其它各处理。处理8周时，S1～S4处理可培养细菌数量分别是CK的53.10、48.50、47.70和25.10倍，各处理细菌数量为S1>S2>S3>S4>S5。

此外，处理后1～4周，细菌数量整体呈上升趋势，4～8周期间，各处理细菌数量整体表现为下降趋势，其中4～6周时下降较快，6～8周期间趋于平缓，这与Foc4及真菌数量变化趋势相似。

2.2.4 可培养放线菌的数量 图5表明，在整个试验期间，各浇灌处理的放线菌数量均高于CK，且不同处理与 CK 之间放线菌数量的差异均达到显著水平。其中，S1处理土壤中放菌数量均最高，第1周时达最大值118.00×105CFU · g-1，其次为S2处理，二者无显著差异，但均显著高于其它处理。处理8周后，S1和S2处理可培养放线菌数量分别是CK的2.10和2.05倍，各处理放线菌数量为S1>S2>S3>S4>S5。此外，处理后1～8周，土壤中放线菌数量整体呈下降趋势，这与Foc4、真菌及细菌数量变化趋势不一致。

图5 不同处理对土壤中放线菌数量的影响Fig.5 Effects of different treatments on actinomycete population in the soil

2.3 土壤微生物特征与香蕉枯萎病病情指数的相关性分析

第8周时，进行了土壤微生物与病情指数的相关分析。从表1可以看出，病情指数与病原菌Foc4及真菌数量呈极显著和显著正相关，与土壤中细菌、放细菌数量呈极显著负相关，说明土壤中Foc4和其它真菌数量是香蕉枯萎病发病程度的主要因素。

3 讨 论

目前，关于菊科植物、几丁质或镰刀菌酸降解菌抑菌作用的研究报道较少[6-11, 14-15]，利用菊科植物、几丁质或镰刀菌酸降解菌对香蕉枯萎病菌的抑制作用防治香蕉枯萎病的研究报道则更少，且都集中于香蕉枯萎菌的抑制效果方面，均未涉及其对土壤微生物的影响及其与防病之间的相关性分析，因此，关于菊科植物、几丁质或镰刀菌酸降解菌对土壤微生物的影响及其与防病之间的相关性研究然仍是空白。本研究探讨2种菊科植物水提液和2株几丁质或镰刀菌酸降解菌对香蕉枯萎病及土壤微生物的影响，以期为香蕉枯萎病的大田综防措施的制订提供参考。

表1 病情指数与土壤中微生物特征的相关性

注：**表示相关性达极显著水平(P<0.01)；*表示相关性达显著水平(P<0.05)。

Note: ** indicate an extreme significant level of correlation (P<0.01); * indicates a significant level of correlation (P<0.05).

向日葵、油麦菜根茎叶水提液及拮抗菌TY和DF对香蕉枯萎病的盆栽防病试验表明，浇灌向日葵、油麦菜根茎叶水提液及拮抗菌TY和DF均可降低香蕉植株的病情指数，其中以向日葵根茎叶水提液处理(S1)和油麦菜根茎叶水提液处理(S2)的病情指数较低，防病效果较好，由此说明油麦菜和向日葵全株水提液抑菌作用比拮抗菌TY和DF强，而向日葵、油麦菜对香蕉枯萎病的后期防病效果有待进行大田试验观察。

植物对土传病害的抗性与根际土壤微生物关系密切，土壤微生物数量和防病效果相关。向日葵、油麦菜根茎叶水提液及拮抗菌TY和DF均抑制了土壤中香蕉枯萎病菌和真菌数量的增长，说明向日葵、油麦菜根茎叶水提液及拮抗菌TY和DF还有可能抑制其他真菌性病原菌的繁殖，这就为防治其他作物的土传真菌性病害提供了可能。相反，同样处理土壤中细菌的数量呈增加趋势，由此说明这施入土壤后在香蕉根系周围形成了有益微生物优势菌群，增加了土壤微生物数量。这与香蕉枯萎病危害程度轻的土壤中细菌数量明显高于危害程度高的土壤的研究结论一致[16-17]。

尽管放线菌数量呈下降趋势，但第8周时，向日葵、油麦菜处理土壤放线菌数量仍分别是对照的2.1和2倍，相关性分析也表明，香蕉病情指数与土壤中病原菌Foc4、普通真菌数量呈极显著和显著正相关，与细菌、放线菌呈极显著负相关，土壤中病原菌Foc4及普通真菌数量的增加有利于病害的发生，细菌、放线菌数量的增加则有利于病害的降低，这一研究结果与丁文娟等[16]研究结论一致。因此，向日葵、油麦菜根茎叶水提液及拮抗菌TY和DF对香蕉枯萎病有防效，不仅源自于自身对病原菌的直接抑制作用，对土壤微生物的生态平衡也有改善作用，进而提高了土壤的抑病性，从而对香蕉枯萎病的扩展起到间接控制作用。

4 结 论

本研究结果表明，在香蕉生长期间浇灌向日葵、油麦菜根茎叶水提液及拮抗菌TY和DF均有利于改善土壤微生物结构，减轻和延缓香蕉枯萎病发生为害，其中向日葵、油麦菜根茎叶水提液对香蕉枯萎病的防控作用及土壤微生物的影响相对明显。这一研究结果可为香蕉—间作或轮作向日葵(或油麦菜)防治香蕉枯萎病提供参考。

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EffectsofAqueousExtractsofSomePlantsandAntifungalStrainsonBananaFusariumWiltDiseaseandSoilMicroorganisms

QI Yan-xiang, ZHANG Xin, PENG Jun, XIE Yi-xian*

(Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Hainan Haikou 571101, China)

【Objective】The present experiment was conducted to investigate effects of two antifungal strains, whole plant aqueous extracts from two Asteraceae plants on banana fusarium wilt disease and soil microorganisms, in order to provide references for the control of banana fusarium wilt disease. 【Method】 Based on the pot trial, effects of two antifungal strainsBurkholderiacepacia(TY) andBacillusamyloliquefaciens(DF), whole plant aqueous extracts fromHelianthusannuusandLactucasativavar.longifoliafLam. on banana fusarium wilt disease,Fusariumoxysporumf. sp.cubenserace4 (Foc4), common fungus, bacterium and actinomyce population were determined and analysed. 【Result】 Banana disease severity and disease index of different treatments were reduced to some extent by applying antifungal strains TY and DF, whole plant aqueous extracts fromH.annuusandL.sativavar.longifoliaf. Furthermore,H.annuusandL.sativavar.longifoliafhad the better effect on control of banana fusairum wilt disease in pot, with the 39.02 % and 34.18 % efficacy, respectively. Compared to the control (CK), four treatments could remarkable increase the number of bacteria, reduce the number of actinomycetes, Foc4 and common fungi in soil. Based on the correlation analysis, the disease-control effect was significantly positively correlated with the number of both Foc4 and normal fungi in soil, but significantly negatively with the number of bacteria and actinomycetes in soil.【Conclusion】Application of antifungal strains TY and DF, whole plant aqueous extracts fromH.annuusandL.sativavar.longifoliafat banana vegetable period could improve soil microorganism structure, reduce or delay banana fusarium wilt disease occurrence, among which effects of whole plant aqueous extracts fromH.annuusandL.sativavar.longifoliafon banana fusarium wilt disease and soil microorganisms are greater than those of antifungal strains TY and DF.

Helianthusannuus；Lactucasativavar.longifoliafLam.；Burkholderiacepacia；Bacillusamyloliquefaciens；Banana fusarium wilt disease；Control effect

1001-4829(2017)5-1092-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.019

2016-06-17

现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-32-04)；海南耕地改良关键技术研究与示范专项课题(HNGDpz2015)；国家自然科学基金项目(31471738)；农业部南亚办专项(16RZBC-16)

漆艳香(1975-)，博士，副研究员，主要从事热带果树病害的诊断、病原学及防治，E-mail: qiyanxiang@ catas.cn，*为通讯作者，谢艺贤(1962-)，研究员，主要从事热带果树病害鉴定与防控技术研究。

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(责任编辑 李山云)