紫果西番莲炭疽病病原菌鉴定及生物学特性研究

谢美华，杨金奎，李雪玲，杨海艳*，陈莉莉，吴 帆

(1.楚雄师范学院化学与生命科学系，云南 楚雄 675000；2.省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650091；3.云南省高校应用生物学重点实验室，云南 楚雄 675000)



紫果西番莲炭疽病病原菌鉴定及生物学特性研究

谢美华1,2,3，杨金奎2，李雪玲1,3，杨海艳1,3*，陈莉莉1，吴 帆1

(1.楚雄师范学院化学与生命科学系，云南 楚雄 675000；2.省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650091；3.云南省高校应用生物学重点实验室，云南 楚雄 675000)

【目的】对紫果西番莲叶片炭疽病病原X-03进行分离鉴定，并对其生物学特性和杀菌剂对X-03的抑制作用进行研究。【方法】采用形态观察与分子生物学相结合的方法。【结果】X-03为刺盘孢属(Colletotrichumsp.)真菌，它的最适生长温度为15～20 ℃，最适生长pH为 pH 8～9，当温度高于50 ℃时X-03菌株的孢子不能萌发。X-03生长最适培养基为PDA，最适碳源和氮源分别为葡萄糖和NaNO3。供试的杀菌剂中以福美双对X-03的抑制效果最好。【结论】研究可为紫果西番莲炭疽病的防治提供理论依据。

紫果西番莲；炭疽病；病原；生物学性状

【研究意义】紫果西番莲(PassifloraedulisSims.)是西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(Passiflora)多年生藤本攀缘植物[1-2]。西番莲具有丰富的营养，被称为“果汁之王”，果汁含量可达果重的30 %～40 %，具有浓郁的香味，且含有较高的有机酸和多达17种以上的氨基酸[3-5]。不仅如此，紫果西番莲根、茎、叶均可入药，性温，无毒，归肺经，有祛风、镇痛、活血、散癖、强体、健心等功效[6]。紫果西番莲具有很大的经济应用潜力，在云南多个地方已有广泛栽培[7]。【前人研究进展】植物炭疽病目前已对紫果西番莲等多种植物造成极大危害[8]，如草莓[9]、黄瓜[10]、切花红掌[11]、油茶[12]和枸杞炭疽病[13]等[14]。目前对紫果西番莲炭疽病病原菌的鉴定和生物学特性方面的研究还未见报道。【本研究的切入点】采取形态学并结合多基因联合分析，对紫果西番莲炭疽病病原菌进行鉴定及生物学特性研究。【拟解决的关键问题】旨在对紫果西番莲炭疽病的防治提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

采集自云南省楚雄师范学院校园内患有炭疽病的紫果西番莲叶片，采用组织法对病原菌进行分离，经科赫氏法鉴定其中一株为紫果西番莲炭疽病的病原菌，菌株编号标记为X-03。

1.2 方法

1.2.1 X-03培养特征和菌株显微结构观察 观察X-03在PAD培养基上的菌落形态、分生孢子、分生孢子梗的形态特征。

1.2.2 rDNA-ITS，rDNA-GDPH序列扩增和分析 用改良CTAB法提取病原菌X-03的基因组DNA[14]。对病原菌的靶基因ITS(Internal Transcribed Spacer)和GPDH(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase)进行扩增，分别以ITS4/ITS5和CDF1/GDR1为引物，PCR扩增X-03菌株的ITS和GPDH序列。扩增产物送上海华大基因生物有限公司测序，所得序列在NCBI上比对，下载与其相似性较高的序列及其近似属的序列。以镰刀菌(Fusariumlateritium)作为外群，利用Clustal x将供试菌株与近源菌株的ITS和GPDH序列分别进行比对，用MEGA5构建各基因系统发育树，并用bootstrap对系统发育树进行检验，1000次重复。

1.2.3 X-03菌株生物学特性研究[10-12]

(1)不同培养基对X-03菌株生长的影响。PDA、紫果西番莲叶煮汁(20 g叶片/L水)PDA (以下简称汁PDA)、燕麦琼脂培养基、玉米培养基，只加蒸馏水和琼脂粉的培养基作对照。

(2)不同温度对X-03菌丝生长的影响。将X-03菌块分别接种在PDA上并置于5、10、15、20、25、30、35 ℃温度下培养5 d并测量菌落直径。

(3)不同 pH条件对X-03生长和孢子萌发的影响。将X-03菌块分别接种到pH值为3～4、4～5、5～6、6～7、7～8、8～9、9～10、10～11的PDA上培养6 d并称其干重。用X-03孢子分别制成1 mL pH为3～4、4～5、5～6、6～7、7～8、8～9、9～10、10～11的孢子悬浮液，28 ℃培养24 h后检测萌发率，每次检测100个孢子。

(4)不同碳源对X-03菌丝生长的影响。用查氏培养基作为基础培养基，分别用相同含碳量的丙三醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖和葡萄糖为唯一碳源，配制成不同的碳源培养基。

(5)不同氮源对X-03生长的影响。以PDA为基本培养基，硝酸钠为氮源，分别用相同含氮量的蛋白胨、氯化铵、硝酸铵和甘氨酸代替硝酸钠，配制成不同氮源培养基。

(6)温度对X-03孢子萌发的影响实验。用X-03孢子制成1 mL孢子悬浮液，分别置于35、40、45、50、55、60 ℃温度下培养， 24 h后镜检孢子的萌发情况。

1.2.4 不同杀菌剂对X-03菌株的抑制作用 用百菌清、甲霜·噁霉灵、福美双和扑海因制成含有相同药效成分带药PDA平板，无菌水作对照。接种相同大小的X-03菌块，28 ℃培养。

以上生物学特性试验中除1.2.3(2)除外，其余均在28 ℃培养5 d后测量菌落直径，每个处理设3次重复。

2 结果与分析

2.1 紫果西番莲炭疽病病原菌的分离、纯化和致病性检测

从患炭疽病的紫果西番莲叶片中分离出到3株真菌，分别编号为X-01、X-02、X-03。分别接种离体叶片结果表明只有X-03号菌株接种的紫果西番莲叶片发病，X-01、X-02菌株和对照组均不发病(表1)。X-03菌株针刺接种和无针刺接种的叶片均在6 d后出现可见病斑，接种部位呈黄褐色至黑褐色，周围出现黑褐色小斑点，第10天病斑逐渐扩大，连成一片(图1)。在叶片发病部位用组织分离法分离所得到的菌株菌落表型特征和X-03一致，表明X-03号菌株为引起紫果西番莲炭疽病的病原菌。

2.2 X-03的形态特征

X-03菌株在PDA平板生长旺盛，菌落正面初始为粉白色、圆形、边缘整齐，菌丝表面呈绒毛状、较疏松，菌落背面为浅黄色菌落。后期菌落逐渐呈粉红色，正面呈现中心圆环形隆起，向外辐射生长，第10 d后在菌丝表面形成大量橘黄色孢子堆；菌落背面以接种菌饼为中心，菌丝向外辐射环形生长。该菌分生孢子直，棒形，单孢、无色，内含原生质颗粒，顶端钝圆一端渐尖，大小为10.33～20.03 μm×2.89～5.84 μm，平均大小为15.54 μm×4.89 μm，长宽比2.31～4.54。该病原菌和刺盘孢属(Colletotrichum)的典型形态特征相符[15](图2)。

图1 离体叶片接种X-03第10天结果Fig.1 Symptoms of the leaves inoculated with X-03 after 10 days

菌株Strains针刺部位Acupuncturesite处理时间(d)Time1～5678910X-01菌株正面针刺------反面针刺------正面非针刺------反面非针刺------X-02菌株正面针刺------反面针刺------正面非针刺------反面非针刺------X-03菌株正面针刺-+++++++++++反面针刺-+++++++++++正面非针刺-+++++++++++反面非针刺-+++++++++++对照4种处理------

注：-表示叶片生长健康；+表示叶片现可见病斑；++表示可见病斑扩大；+++表示病斑变黑，叶片腐烂。 Note: -means leaf grow healthily; + means visible diseased spots; ++ means visible bigger diseased spots; +++ means visible black diseased spots and the leaves start decay.

2.3 X-03的ITS和GPDH基因测序和系统聚类分析

X-03的ITS和GDPH的扩增序列分别为573和225 bp。利用MEGA 4.0软件构建了ITS和GDPH构建系统进化树(图3)。X-03与C.brevisporum、G.magna聚为一支，节点支持率为99 %，说明三者亲缘关系较近；X-03与C.cliviae也有一个节点，节点支持率为100 %，说明二者的亲缘关系也较近。系统进化分析表明X-03与刺盘孢属(Colletotrichum)真菌的亲缘关系最近，综合形态学特征分析，X-03菌株被鉴定为刺盘孢属 (Colletotrichumsp. X-03)。

2.4 病原菌X-03的生物学特性研究

2.4.1 不同碳源和氮源对X-03菌株生长的影响 X-03菌株对供试的5种氮源均能利用，菌落在不同氮源培养基上生长速度有明显差异，该菌生长的最适氮源是NaNO3，其与蛋白胨、甘氨酸、NH4Cl和NH4NO3达到极显著差异。供试的5种碳源均能利用，菌落在不同碳源培养基上的生长速度差异不明显，该菌生长的最适碳源是葡萄糖，其与乳糖、淀粉达到极显著差异(表2)。

2.4.2 不同温度对X-03菌落生长的影响 接种在PDA上的X-03在10～35 ℃范围内均能生长，其最适的生长温度为15～20 ℃，在35 ℃时生长缓慢(图 4)。

A：菌株X-03的菌落形态特征；B：40倍镜下观察到的分生孢子，标尺为10 μmA: Colony of X-03; B: conidia of X-03 are observed under the microscope, and the bar is 10 μm图2 菌株X-03的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of X-03

图3 X-03基于ITS和GPDH序列构建的NJ树 Fig.3 The phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method based on ITS and GPDH sequences

2.4.3 不同培养基对X-03菌落生长的影响 X-03菌株在PDA、汁PDA、玉米粉、燕麦培养基以及对照上均能生长；菌株在PDA、汁PDA和燕麦培养基上生长较快，3者之间差异不显著(P>0.05)，但它们与玉米粉培养基和对照的差异极显著(P<0.01)(图5)。2.4.4 不同pH对X-03生长和孢子萌发的影响 在PDA培养基中，X-03菌丝和分生孢子萌发适宜的pH值范围较广，在pH 3～11均能生长和萌发。pH 8～9时该菌的菌落直径最大，同时孢子的萌发率也最高(表3)。

表2 不同氮源和碳源对X-03菌株生长的影响

注：表中不同大写字母表示在P<1 %水平差异极显著，不同小写字母表示在P<5 %水平差异显著。下同。 Note: Different capital letters mean significant difference at the 1 % level, different lowercase letters mean significant difference at the 5 % level. The same as below.

表3 不同pH对X-03菌株生长和孢子萌发的影响

表4 温度对X-03孢子萌发的影响

注：+表示孢子可萌发；-表示孢子不萌发。

Note： + means that spores can germinate; -means that spores cannot germinate.

图4 不同培养温度对菌丝生长的影响Fig.4 Effect of different temperature on mycelial growth

图5 不同培养基对X-03菌丝生长的影响Fig.5 Effect of different media on mycelial growth

2.4.5 温度对X-03孢子萌发的影响 接种在PDA上的X-03菌株孢子在35～45 ℃均能萌发，50 ℃以上孢子不能萌发(表4)。

2.5 不同杀菌剂对X-03菌落生长的影响

与对照相比，4种杀菌剂对该菌的生长均有抑制作用。福美双对该菌株的抑制效果最好，其次是百菌清和甲霜灵，抑制效果最差的是扑海因(图6)。

3 讨 论

3.1 紫果西番莲病原菌的分离鉴定

对紫果西番莲炭疽病叶片病菌进行分离与纯化得到3个菌株，其中X-03为引起紫果西番莲炭疽病发病的病原菌。X-03接种离体叶片结果表明叶片有无伤口均能发病，说明该菌通过直接侵染或机械伤口均能侵染紫果西番莲，因此在种植时要注意病虫害的及时防治和考虑合理种植密度，避免害虫造成的伤口和种植密度太大叶片发生摩擦使叶片受到机械损伤产生伤口，从而通过伤口侵入加速该病害的传染和扩散。依据X-03菌株的分生孢子和菌落形态等表型特征，并结合ITS和GPDH基因的系统进化分析结果把X-03菌株鉴定为刺盘孢属(Colletotrichumsp. X-03)真菌。

图6 不同杀菌剂对菌丝生长的影响Fig.6 Effect of different germicides on mycelial growth

3.2 病原菌生物学特性研究

X-03菌株对营养要求不高，能利用的碳源和氮源较广。最适的生长培养基为PDA，对供试的5种碳源均能利用，最适碳源为葡萄糖和蔗糖，说明该菌能很好利用单糖、双糖类中的碳源，这与多数真菌对碳源的利用能力相同[16-19]；对供试的5种氮源均能利用，最适氮源为NaNO3，说明X-03可能是嗜硝态氮类真菌；pH 8～9时分生孢子的萌发率最高，菌丝的生长也最好；X-03在15～20 ℃生长速度最快。本研究结果与该病害易在初春季节侵染叶片，引发叶斑病的发病规律相吻合。

3.3 杀菌剂对病原菌X-03生长的影响

供试的4种杀菌剂对X-03菌株的生长均有抑制作用。福美双对该菌株的抑制效果最好，其次是百菌清和甲霜灵，扑海因效果最差。供试杀菌剂对该病在大田的防治效果需进一步试验验证。

4 结 论

引起紫果西番莲叶片炭疽病的病原菌为刺盘孢属(Colletotrichumsp. X-03)真菌，该病害易于初春传播蔓延，福美双对该病害的防治效果较好。

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(责任编辑 王家银)

Study on Identification and Biological Characteristics of Anthracnose Pathogen ofPassifloraedulis

XIE Mei-hua1,2,3, YANG Jin-kui2, LI Xue-ling1,3, YANG Hai-yan1,3*, CHEN Li-li1, WU Fan1

(1.Department of Chemistry and Life Science, Chuxiong Normal University, Yunnan Chuxiong 675000, China; 2.Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources, Key Laboratory of Microbial Diversity in Southwest China, Ministry of Education, Yunnan University, Yunnan Kunming 650091, China; 3.Yunnan Province Applied Biology Key Laboratory of University, Yunnan Chuxiong 675000, China)

【Objective】The pathogen (X-03) of plant anthracnosis was identified fromPassifloraedulis, and it’s biological characteristics and inhibition effect of four fungicides on X-03 were investigated. 【Method】Morphologic observation combined with molecular biological techniques were employed in the paper. 【Result】The results showed that X-03 belonged to genusColletotrichum, and the optimal growth condition for this fungus was 15-20 ℃ and pH 8-9, while the spores could not germinate when the temperature over 50 ℃. The most suitable medium was PDA for X-03, and the optimal C and N sources were glucose and NaNO3, respectively. The inhibitory effect of Thiram on X-03 was more obvious than other tested germicides. 【Conclusion】This study could provide a theoretical basis for the prevention and control of anthracnose ofPassifloraedulis.

Passifloraedulis; Anthracnosis; Pathogen; Biological characteristics

1001-4829(2017)6-1358-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.021

2016-11-15

楚雄师范学院后备人才资助项目(XJRC1502)；云南省重点建设学科，楚雄师范学院重点建设学科基金项目(05YJJSXK03)；云南省高校科技创新团队支持计划项目(IRTSTYN)；云南省教育厅项目(2014Y443)；云南省教育厅科学研究基金项目(2017ZZX016)

谢美华(1981-)，女，云南楚雄人，实验师，硕士研究生，主要研究方向为微生物分子生物学，E-mail: xiemeihua@cxtc.edu.cn，Tel:0878-3100784, *为通讯作者：杨海艳，E-mail:haiyanyang@cxtc.edu.cn。

S667.9

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