漾濞大泡与云新高原核桃花粉活力及柱头可授性比较

胡 青，肖良俊，吴 涛，宁德鲁，陈少瑜*

(1.云南省木本油料工程技术研究中心, 云南 昆明 650201; 2.云南省林业科学院, 云南 昆明 650201)



漾濞大泡与云新高原核桃花粉活力及柱头可授性比较

胡 青1,2，肖良俊1,2，吴 涛1,2，宁德鲁1,2，陈少瑜1,2*

(1.云南省木本油料工程技术研究中心, 云南 昆明 650201; 2.云南省林业科学院, 云南 昆明 650201)

【目的】明确漾濞大泡和云新高原2个核桃品种的花粉活力和柱头可授性。【方法】用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定花粉在3种贮藏条件下(室温、冰箱冷藏和冷冻)的活力变化；采用联苯胺-过氧化氢法、过氧化物酶-酯酶试纸法、苏丹红染色法3种方法测定不同时期雌花柱头可授性。【结果】在相同保存温度下，云新高原核桃的花粉活力高于漾濞大泡。冰箱冷藏条件有利于花粉保存，保存至第7天时漾濞大泡和云新高原的花粉活力分别从第1天的88.7 %和95.5 %下降至10.0 %和18.3 %。氧化物酶-酯酶试纸法检测柱头可授性操作简单、效果较好。【结论】漾濞大泡和云新高原核桃的雌花柱头在V字期开始具有一定的可授性，八字期具有较强的可授性，是其授粉的最佳时期。

深纹核桃；漾濞大泡；云新高原；花粉活力；柱头可授性

【研究意义】云南种植的核桃主要是深纹核桃(Juglanssigillata)，与中国北方产区的普通核桃(J.regia)在适生生态环境、抗逆性、丰产性及果实品质等方面存在着明显的差异[1]。漾濞大泡核桃(J.sigillatacv. ‘Yangbidapao’)是云南传统主栽的深纹核桃品种，具有个大壳薄、出仁率及含油率高、仁色浅黄、食味香纯等优点，但存在结实晚(约10a 左右)、收益慢等问题。【前人研究进展】据此，云南省林业科学院通过种间杂交途径，即漾濞大泡核桃与新疆早实核桃进行杂交，培育出云新高原(J.sigillata×regiacv. ‘Yunxingaoyuan’)等早实杂交核桃新品种，并于2004年通过云南省林木品种审定委员会审定[2-3]。云新高原经过嫁接繁殖，1年生嫁接苗定植后2～3年开花结果，5年进入初盛果期，其果实比漾濞大泡核桃提早20～35 d成熟[3]。云新高原早实、早熟、优质及树体矮化等性状稳定，但产量不够稳定，其主要原因之一就是核桃为雌雄同株异花异熟的风媒授粉植物，花期不一致和雌花受粉高峰期较短不利于其传粉坐果，因此，配置适宜的授粉树品种可提高结实率，增加产量[4]。花粉活力和柱头可授性是影响授粉受精的两个非常重要制约因子，只有充分了解不同核桃品种的花粉活力和柱头可授性特点，才可能科学地进行树种配置，提高授粉受精率，进而提高结实率。【本研究切入点】目前，有关核桃花粉活力和柱头可授性研究都集中于普通核桃[5-9]，深纹核桃及杂交种相关方面的研究未见报道。另外，云南省核桃种植面积截止2015年底时已达282万hm2，干果产量达到85万t，产值为281.5亿元，面积、产量和产值均居全国之首[10]。进一步利用云南丰富的种质资源选育出适应性更广、品质更优良的核桃品种成为当前云南核桃培育工作的重要内容。【拟解决的关键问题】杂交育种是核桃新品种培育的重要途径，保证花粉具有生命力和柱头在适宜的可授期是确保杂交育种成功的前提条件。因此，研究核桃花粉生活力、花粉适宜的保存温度及柱头可授性具有重要的应用价值。本研究以漾濞大泡核桃和云新高原核桃2个品种为研究对象，测定不同保存条件下二者花粉活力情况及柱头不同时期的可授性，筛选出适宜的花粉贮藏方式及其柱头可授性最佳时期，为这2个核桃品种相关的人工授粉和杂交育种工作提供基础信息。

1 材料与方法

1.1 研究地区概况

研究地点位于昆明市盘龙区云南省林业科学院昆明树木园的核桃种质资源收集圃内。海拔1970 m，年平均气温14.7 ℃，绝对最低温-7.8 ℃，绝对最高温31.5 ℃，年≥10 ℃的积温4799.3 ℃，平均霜期85 d，年降水量1100 mm，相对湿度72 %，全年日照时数大于2249.3 h。

1.2 实验材料

漾濞大泡和云新高原核桃均为嫁接苗，株龄分别为15年生和12年生，每品种3～5株作为观察和采样对象。

1.3 研究方法

1.3.1 花粉活力测定 采集盛花期树体中上部，花药变黄、松散但尚未开裂的雄花序，平铺在硫酸纸上，置于25 ℃温箱内任其花药自然开裂散粉。次日，收集花粉于2 mL离心管中密封，分别放置于室温、冰箱冷藏室(4±2 ℃)和冰箱冷冻室(-20±2 ℃)中保存。用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法进行花粉活力测定[11]。测定时，将0.1 %的TTC滴于载玻片上，用毛笔蘸花粉后将其抖落在TTC液滴上，盖上盖玻片，置于铺有湿润滤纸的培养皿内，于培养箱中30 ℃下避光放置24 h。在显微镜下观察花粉着色情况，红色的记为有生活力的花粉。每个载玻片观察6个视野，共观察3个载玻片。

花粉活力( %)=(着色花粉数量/总的花粉数量)×100。

1.3.2 雌花柱头可授性检测 采用3种方法进行柱头可授性检测，测定核桃雌花从开花到谢花这段时间柱头可授性的变化，确定雌花开花后柱头具备可授性的时期[12]。①联苯胺-过氧化氢法(质量分数为1 %的联苯胺∶质量分数为3 %的过氧化氢∶水 = 4∶11∶22，体积比)。将不同开花时期的核桃雌花柱头切下，浸入添加了新制联苯胺-过氧化氢反应液的离心管盖中，观察柱头颜色变化和产生气泡的情况。②过氧化物酶-酯酶试纸法。取15 mm × 15 mm大小的试纸溶于1 mL双蒸水中，将柱头浸入该试纸水溶液中，如柱头变蓝，则柱头进入可授期。③苏丹红染色法。将切下的柱头浸入2 %质量分数的苏丹红溶液中，观察柱头脂类分泌物的变化情况，根据柱头表面出现被染成红色油滴状物质的多少判断其可授性。每种方法每次检测5朵花，重复3 次。

2 结果与分析

2.1 不同保存条件对花粉活力的影响

由图1可知，在相同保存条件下，云新高原的花粉活力整体高于漾濞大泡核桃1.8 %～3.8 %，且差异性不显著(P=0.83～0.93 > 0.05)，说明在常温、冷藏和冷冻保存条件下二者的花粉活力一致，无明显区别。但不同保存条件下花粉活力差异较大，冷藏条件下保存的漾濞大泡和云新高原的花粉活力最高，分别从保存第1天的88.7 %和95.5 %下降至第7天的10 %和18 %。而常温保存的漾濞大泡和云新高原的花粉活力最低，分别从保存第1天的82.7 %和88.5 %下降至第7天的0.4 %和3.5 %。冷冻保存的花粉活力介于室温保存和冷藏保存之间。

图1 不同保存条件下漾濞大泡和云新高原花粉活力变化Fig.1 Pollen viability of Yangbidapao and Yunxingaoyuan at different preserved conditions

图2 不同时期的雌花柱头及其染色结果Fig.2 Stigma receptivity and its detection results of pistil stigma at each development stage

2.2 雌花开花进程的形态变化

漾濞大泡和云新高原的雌花花期均为10～12 d，但漾濞大泡的雌花花期比云新高原晚22～24 d，云新高原的雌花于3月4日进入初花期，3月8日进入盛花期，3月14日进入末花期；漾濞大泡于3月26日进入初花期，4月1日进入盛花期，4月7日进入末花期。二者雌花花期的外部形态变化一致，根据外部形态变化，可将其分成5个阶段(图2)，即显花期、初开期、V字期、八字期和翻卷期。显花期花闭合，柱头包裹其中，持续3～5 d。初开期，花被开裂，柱头伸展并高出花被，略开张，两裂柱头夹角5°～15°，可见柱头表面具突触状的腺质细胞，漾濞大泡的腺质细胞呈浅粉红色，云新高原呈嫩绿色，持续1～2 d。V字期，柱头伸长并张开呈V字型，柱头夹角15°～45°，持续1～2 d。八字期，柱头夹角45°～120°，腺质细胞充分伸展，表面可见湿性分泌物，此时期持续时间因是否授粉而有所不同，经过授粉比未授粉的柱头较快变干并翻卷，干热或大风气候也会使柱头较快干缩，持续1～5 d。翻卷期，柱头平展并向下翻卷，柱头夹角基本不再变化，柱头萎蔫逐渐干枯，持续2～3 d。雌花的子房从显花期到八字期生长膨大，最粗直径从2～3 mm增至5 mm左右，子房未膨大的雌花在花期结束前萎蔫枯黄自花柄端脱落。

2.3 柱头可授性检测结果

过氧化物酶-酯酶法和苏丹红法检测漾濞大泡和云新高原雌蕊柱头可授性时，可观察到明显的颜色变化，而联苯胺-过氧化氢法检测时，柱头有大量气泡产生，少许腺质细胞呈现蓝黑色，但颜色变化不明显，不利于结果的观察。

氧化物酶-酯酶法和苏丹红法染色结果(图2)可以看出，雌花初开期，经检测在柱头边缘的触突状腺质细胞具有较弱的可授性。随着柱头生长和张开角度逐渐增大，其表面的触突状腺质细胞伸展、光亮，有黏液产生，经检测八字期具有较强的可授性，表现为柱头变色快、着色深，着色部位主要集中在柱头表面。翻卷期如果触突状腺质细胞还不干枯，则仍能染色明显；如果腺质细胞干枯，则染色不明显。漾濞大泡和云新高原的染色观察结果基本一致，均在V字期开始具有一定的可授性，八字期具有较强的可授性，翻卷期柱头萎蔫后不具可授性。

3 讨 论

花粉具有活力是完成受精的必要条件，既受物种和品种自身内在遗传因素的影响，又受温度、湿度、光照等外部环境因素的影响[13]。在诸多的环境因素中，温度和湿度是影响花粉寿命的主要因子，是选择花粉贮藏方法时必须着重考虑的因素。在室温条件下，花粉的寿命往往很短。如苹果花粉在常温条件下经7～8 d，西南桦、光皮桦的花粉经3～4 d即失去活力[14]。苹果、杜梨、桃和枣等12种果树的花粉贮藏研究结果表明，冰箱冷冻室的贮藏效果明显优于冷藏室，花粉离体萌发率可提高7.5 %～27.2 %[15-16]。亲缘关系越近的植物种类，其花粉寿命越一致[17]。漾濞大泡核桃和普通核桃同属胡桃属，云新高原是二者的种间杂交种，已有的普通核桃花粉活力相关文献与本项研究结果具有很好的参考比较价值。

杜晋城等[9]测定4种温度条件下保存的花粉活力，室温为10～12 d；2～5 ℃ 为25～28 d；-20 ℃为10 d；-70 ℃保存时间不到1 d。任列花[5]、齐国辉[6]、刘昊[7]、缑锋利[8]等的研究，普通核桃花粉常温下多数品种能保持4～7 d，4 ℃冰箱冷藏能保持10～20 d，4 ℃冰箱的温湿度对于保持花粉活力比较适宜。本研究检测核桃花粉活力，漾濞大泡和云新高原刚散粉时花粉活力高达88.7 %和95.5 %，随保存时间的延长而下降；不同保存条件对核桃花粉活力影响较大。4 ℃冰箱冷藏保持花粉活力比较适宜，漾濞大泡和云新高原保存7 d后花粉活力还能达到10.0 %和18.3 %；而自然状态下花粉活力丧失较快，保存7 d 后只有0.4 %和3.5 %，基本丧失活力；-20 ℃冰箱冷冻保存的花粉活力介于室温和冷藏之间，结论与普通核桃的研究[7-8]基本一致，但远低于杜晋城等[9]的研究结果，高于齐国辉等[6]的研究结果。可能是物种及品种不同的缘故，或是花粉采收时含水率不同及保存环境的湿度差异所致。因而花粉的保存，需要综合考虑物种、品种、温度、湿度等因素，以期达到最佳保存时间，满足人工授粉和杂交育种工作的要求。

柱头可授性是花朵成熟过程中的一个重要时期，它能在很大程度上影响开花不同阶段的传粉成功率。不同植物的柱头可授性差异较大，白杨派树种进入最佳授粉时期时的柱头开裂角度约为180°[13]；美国山核桃品种马汉柱头开裂明显，初花期并无可授性，V字期可授性逐渐增强并持续至倒八字初期，该阶段为授粉最佳时期[18]。核桃柱头伸出略张开时已具有可授性，柱头开裂角度为90°～120°时可授性最强[7]。深纹核桃雌花初花期到未花期大概需要20 d左右，期间雌花柱头和子房会发生外部形体的变化，为准确界定和区分雌花柱头可授性的适宜时期，根据雌花柱头开花形态可划分为5个时期——显花期、初开期、V字期、八字期和翻卷期，与刘昊[7]、张琴和刘德良[19]的研究结果基本一致。

4 结 论

本研究检测的漾濞大泡和云新高原核桃花粉活力随保存时间的延长而下降，不同保存条件对核桃花粉活力影响较大，4 ℃冰箱冷藏保持花粉活力比较适宜。本研究，采用了联苯胺-过氧化氢法、苏丹红染色法和过氧化物酶-酯酶试纸法进行雌花柱头可授粉性的检测，氧化物酶-酯酶试纸法检测柱头可授性的成本较高，但效果、简便性优于联苯胺-过氧化氢法和苏丹红染色法，可优先考虑。对漾濞大泡和云新高原核桃柱头可授性检测结果表明，柱头在V字期开始具有一定的可授性，八字期具有较强的可授性，翻卷期可授性丧失。

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(责任编辑 王家银)

Study on Pollen Viability and Stigma Receptivity of Two Walnut Cultivars Yangbidapao and Yunxingaoyuan

HU Qing1,2, XIAO Liang-jun1,2, WU Tao1,2, NING De-lu1,2, CHEN Shao-yu1,2*

(1.The Woody Oil Engineering Research Center of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650201, China；2.Yunnan Academy of Forestry, Yunnan Kunming 650201, China)

【Objective】The pollen viability and stigma receptivity of two walnut cultivars (J.sigillatacv. ‘Yangbidapao’ andJ.sigillata×regiacv. ‘Yunxingaoyuan’) planted in Kunming were studied in this paper. 【Method】The period and conditions (room temperature, cold-storage and frozen-storage) for keeping high pollen viability were detected by triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining method. The stigma receptivity and optimal pollination period were evaluated by benzidine-H2O2, peroxidase-esterase reagent and sudan Ⅲ staining method. 【Result】The results showed that the pollen viability of Yunxingaoyuan was higher than that of Yangbidapao at the same storage condition. The cold-storage was conducive to keeping high pollen viability, and which of Yangbidapao and Yunxingaoyuan were decreased to 10.0 % and 18.3 % respectively after seven days. 【Conclusion】The peroxidase-esterase reagent method was the best way to monitor the stigma receptivity, and the best period of pollination was the stigma opening angle ranging from 45 to 120 degrees.

Juglanssigillata；Yangbidapao；Yunxingaoyuan；Pollen viability；Stigma receptivity

1001-4829(2017)6-1434-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.033

2016-05-23

云南省应用基础研究计划青年项目(2013FD075)；国家科技支撑计划项目(2011BAD46B01)；国家自然科学基金项目(31660214)

胡 青(1986-)，女，江西吉安人，博士，从事生态学研究，E-mail: qing-hu08@163.com，*为通讯作者：陈少瑜，E-mail: sherry9872@163.com。

S718.3

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