火龙果离体培养茎段灭菌及芽诱导增殖研究

牟海飞，刘洁云，黄永才，邓福斌，吴艳艳，黄伟华，吴代东，梁桂东，黄黎芳

(1.广西农业科学院生物技术研究所，广西 南宁 530007；2.三亚缘之海农业科技有限公司，海南 三亚 572000；3.广西农业科学院园艺研究所，广西 南宁 530007)



火龙果离体培养茎段灭菌及芽诱导增殖研究

牟海飞1，刘洁云1，黄永才1，邓福斌2，吴艳艳1，黄伟华1，吴代东1，梁桂东3，黄黎芳3

(1.广西农业科学院生物技术研究所，广西 南宁 530007；2.三亚缘之海农业科技有限公司，海南 三亚 572000；3.广西农业科学院园艺研究所，广西 南宁 530007)

【目的】探讨火龙果茎段灭菌及芽诱导增殖技术，为研发火龙果组织培养技术提供支撑。【方法】以桂红龙1号火龙果茎段为外植体，研究不同因素对火龙果茎段灭菌及芽诱导增殖过程的影响。【结果】茎段大小是影响灭菌效果的主要因素，其次是灭菌时间，茎段老熟程度的影响相对较小。灭菌时间对芽诱导的影响最大，6-BA浓度次之，茎段老熟程度和茎段大小对芽诱导影响较小，且差别不大。6-BA 4.0 mg/L时芽诱导效果最佳。6-BA浓度越高，芽增殖倍数越高，但当6-BA达到4.0 mg/L时，芽出现玻璃化现象。IAA的芽增殖效果优于NAA，IAA为0.1 mg/L时芽增殖效果较好。在培养基中添加PP333对抑制玻璃化促进火龙果组培苗继代增殖的效果优于AC。【结论】适宜茎段灭菌及芽诱导的方案为：选取生长1个月左右的健康茎段，切成含1个芽眼的小段，用0.1 %HgCl2溶液灭菌10 min，将灭菌的茎段接种至MS+6-BA 4.0 mg/L培养基。适宜芽继代增殖的培养基配方为：MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L+PP333 1.0 mg/L。

火龙果；离体培养；灭菌；继代增殖

【研究意义】火龙果(Hylocereusundatus)又称红龙果、芝麻果、仙蜜果等，为仙人掌科量天尺属的果用栽培种。火龙果营养丰富，属高纤低糖、低脂肪食品，其花和果实可加工成各种营养保健品[1]。火龙果种植具有较好的经济效益，近年来，我国广西、广东、海南、云南、贵州和福建等省区均有较大面积栽培，已成为农业的新、优、特、高开发项目[2]。目前，火龙果在生产上基本采用扦插繁殖。近年来火龙果种植发展迅速，火龙果种苗需求旺盛，由于大量从田间采集茎段作为种源，因此出现了种苗来源不明、品种杂乱等现象，特别是茎段携带溃疡病等重大病虫的情况难以避免，种苗的不健康隐患对生产构成了严重威胁。组织培养具有环境因子可人工控制，繁殖周期短，速度快，效率高，可周年生产，节省材料，保持植物原有优良性状等优势，利用组织培养技术能有效解决现阶段火龙果种苗健康、品种纯度等方面的问题。【前人研究进展】近年来，有一些学者对火龙果组织培养进行研究。黄春华等[3]研究表明，火龙果外植体的选择以近老化茎段为宜，试验品种蜜宝火龙果适宜使用较低浓度的激素，可能是品种差异导致材料对激素的敏感程度不同。王云山等[4]发现火龙果外植体芽眼的丛刺处容易出现污染，这是由于芽眼处有成丛的叶刺，很难清洗干净，消毒剂也较难透入，灭菌很难彻底。彭绿春等[5]研究认为保留火龙果外植体刺座上小刺和绒毛更利于诱导不定芽萌发，推测拔除小刺和绒毛的过程中，有可能使不定芽原基造成损伤，或不定芽原基被直接拔除。刘颖等[6]对火龙果芽增殖、伸长的培养基进行筛选，结果表明适宜火龙果芽增殖的培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L，适宜火龙果芽伸长的培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+ IAA 0.5 mg/L。张领等[7]选取火龙果茎段上芽刺座进行不定芽诱导分化、增殖，得出适宜继代增殖的培养基为MS+6-BA 9.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，增殖倍数达12倍。【本研究切入点】目前有关火龙果组织培养的研究较少，主要集中在外源激素对火龙果组培增殖及生根的影响方面，且不同品种的火龙果适宜的培养基不同，有关火龙果茎段灭菌及芽诱导的影响因子、组培苗继代增殖过程中的玻璃化问题研究尚未见深入报道。【拟解决的关键问题】以火龙果茎段为外植体，研究茎段老嫩程度、外植体大小、灭菌时间和6-BA浓度对灭菌及芽诱导过程的影响；研究细胞分裂素和生长素的种类和浓度对火龙果离体培养增殖的影响，以及不同浓度的活性炭(AC)、多效唑(PP333)对降低火龙果继代过程中芽玻璃化率的效果，筛选出适宜的火龙果外植体灭菌及芽诱导增殖方案，为研发火龙果组织培养技术提供支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为火龙果品种桂红龙1号，由广西农业科学院园艺研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 火龙果茎段灭菌及芽诱导 选择生长健壮、无病虫害的火龙果茎段，用洗洁精溶液刷洗表面，芽眼处重点刷洗，流水冲洗30 min。

外植体灭菌及芽诱导处理采用L9(34)正交试验设计(表1)，设4个因子，茎段老熟程度：分别选择生长1、3和5个月的茎段；茎段大小：分别含1、2 和3个芽眼，其中含1个和2个芽眼的茎段处理方式为将茎段沿波浪形棱缘纵切成棱片(即去除髓部)，再将棱片分别横切成大小相似的含1 和2个芽眼的小段，含3个芽眼的茎段处理方式为不去除髓部，直接将茎段横切成大小相似的含3个芽眼的小段；灭菌时间：分别用0.1 %HgCl2(加1～2滴吐温80)浸泡6、10和14 min，无菌水冲洗4次后，用无菌滤纸吸干表面水分；6-BA浓度：以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA(2.0，3.0和4.0 mg/L)作为火龙果茎段芽诱导培养基。每个处理接种30瓶，每瓶接种1个外植体，3次重复。观察并记录茎段污染情况和芽诱导情况。

1.2.2 火龙果组培增殖 以MS为基本培养基，6-BA浓度设置为：2.0、3.0、4.0 mg/L，生长素选用NAA和IAA，生长素浓度设置为：0.1、0.5 mg/L，分别与不同浓度的6-BA组合。将诱导出的不定芽接种至不同培养基，每个处理接种30瓶，每瓶接种6个芽，3次重复。观察并记录芽增殖倍数及生长情况。

将上一个试验筛选出的最佳培养配方作为基本培养基，分别添加活性炭(AC)、多效唑(PP333)，AC浓度：0、0.3、0.6、0.9、1.2 g/L，PP333浓度：0、0.2、0.5、1.0、1.5 mg/L。一共进行3次继代培养，每次继代筛选健康无玻璃化现象的芽接种至上述培养基，每个处理接种30瓶，每瓶接种6个芽，3次重复，观察并记录3次继代培养的芽增殖倍数及玻璃化率。

表1 火龙果茎段灭菌及芽诱导正交试验因素水平

培养条件：培养基内均含3 %蔗糖和0.5 %琼脂，培养基pH(5.8±0.1)，于121 ℃高温下灭菌20 min。培养温度为(28±2)℃，光照强度为1500～2000 lx，光照时长为12 h/d。

1.3 统计分析

茎段污染及芽诱导情况均于接种后1周开始观察，2周统计结果。芽增殖情况、玻璃化率接种后1周观察1次，30 d统计结果。

污染率( %)=茎段污染数/接种的茎段总数×100

芽诱导率( %)=发芽的芽眼数/接种的芽眼数×100

芽增殖倍数=培养后的芽总数/接种的芽总数

玻璃化率( %)=玻璃化的芽数/生长的芽数×100

2 结果与分析

2.1 不同处理对火龙果茎段灭菌及芽诱导的影响

从表2～3可以看出，不同处理组合对火龙果茎段灭菌及芽诱导存在较大影响。在茎段灭菌阶段，R值大小顺序为：B(29.62)>C(15.48)>A(5.97)，茎段大小是影响灭菌污染率的主要因素，其次是灭菌时间，茎段老熟程度的影响相对较小。根据不同因素K值可知，污染率最低的处理为：茎段老熟程度为1个月，茎段大小为含1个芽眼，灭菌时间14 min。在芽诱导阶段，R值大小顺序为：C(27.17)>D(14.06)>A(3.01)>B(2.34)，灭菌时间对火龙果茎段芽诱导的影响最大，6-BA浓度次之，茎段老熟程度和茎段大小对芽诱导影响较小，且差别不大。根据不同因素K值可知，火龙果芽诱导率最高的处理为：茎段老熟程度为3个月，茎段大小为含3个芽眼，灭菌时间6 min，芽诱导培养基为MS+6-BA 4.0 mg/L。茎段老熟程度、茎段大小和灭菌时间3个因子对污染率和诱导率的影响正好相反，从K值可知，火龙果茎段灭菌最佳处理方案的芽诱导效果最差。其中灭菌时间对污染率和诱导率的影响较大，根据表2的试验结果，0.1 %HgCl2灭菌10min效果相对较好。而茎段老熟程度、茎段大小对芽诱导影响较小，因此茎段老熟程度为1个月，茎段大小为含1个芽眼，灭菌时间10 min的处理方法对污染率和诱导率影响效果相对较好。

表2 不同处理对火龙果茎段灭菌及芽诱导的影响

表3 火龙果茎段灭菌及芽诱导试验直观分析

表4 不同处理对火龙果芽增殖的影响

2.2 不同处理对火龙果继代增殖的影响

由表4可知，不同浓度的6-BA对火龙果芽增殖的影响不同，可以看出，6-BA浓度越高，芽增殖倍数越高，但当6-BA达到4.0 mg/L时，火龙果芽出现玻璃化现象，影响其生长。NAA和IAA 2种生长素对火龙果芽增殖的影响效果不同，总体看来，添加IAA的培养基芽增殖倍数高于添加NAA的培养基，且芽生长情况也相对较好。IAA为0.5 mg/L时各处理的芽增殖倍数总体高于IAA为0.1 mg/L时，但芽的玻璃化现象也相对严重。综合各因素后可以得出，以MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L的芽增殖效果最佳，芽增殖倍数为4.71，芽粗壮，生长正常。

2.3 不同浓度活性炭对火龙果继代增殖的影响

由表5可知，培养基中不添加活性炭，火龙果芽的玻璃化率会随着继代次数的增加而上升，第3次继代已达到38.22 %，芽增殖倍数先上升后显著下降，第3次继代为3.03。添加活性炭能有效降低玻璃化率，活性炭浓度为1.2 g/L时，3次继代的玻璃化率为零。但随着活性炭浓度的升高，第1次继代和第2次继代的芽增殖倍数呈下降趋势，且不定芽颜色黄绿，生长缓慢。当添加活性炭浓度为0.6 g/L时，芽生长情况较好，3次继代的芽增殖倍数相对稳定，平均4.23，玻璃化率较低且增幅小。

2.4 不同浓度多效唑对火龙果继代增殖的影响

从表6可以看出，随着继代次数的增加，各处理的玻璃化率呈上升趋势。PP333对降低火龙果玻璃化率效果较好，添加PP333的处理玻璃化率都低于对照，且PP333还具有壮苗效果，与对照相比不定芽生长更健壮，第2、3次继代时壮苗效果显著。总体而言，随着PP333浓度的增加，芽增殖倍数和玻璃化率先上升后下降。其中，PP333浓度为1.0 mg/L时效果最佳，3次继代的平均芽增殖倍数为5.03，第2次继代玻璃化率0.81 %，第3次继代玻璃化率2.00 %。

表5 不同浓度活性炭对火龙果继代增殖的影响

表6 不同浓度多效唑对火龙果继代增殖的影响

3 讨 论

污染、褐化、玻璃化三大问题被认为是植物组培的三大难题，其中污染最容易发生[8]。在外植体灭菌过程中，有很多因素会造成污染。外植体越大，灭菌越困难。尤其是火龙果茎段芽眼处有丛生的叶刺和绒毛，灭菌剂难渗入，是火龙果灭菌的重点部位。HgCl2灭菌剂浸泡时间越长，灭菌效果越好，污染率越低。但HgCl2毒性非常强，易对外植体造成毒害作用，影响发芽率。植株在自然环境下生长时间越长带菌越多[9]，以幼嫩茎段作为外植体可降低污染率。

细胞分裂素在植物组培中的主要作用是促进细胞的分裂和分化，诱导不定芽的形成。较低浓度的生长素配合细胞分裂素使用，可以促进细胞伸长，以及不定芽的萌发和生长[10]。培养基中6-BA达到一定浓度后火龙果组培苗出现玻璃化现象，与其他有关高浓度激素诱导组培苗玻璃化的报道相一致[11]。6-BA浓度偏低时茎段芽增殖倍数较低，且芽生长到一定长度后顶端坏死停止生长。本试验选用NAA和IAA 2种生长素与6-BA组合诱导火龙果茎段芽增殖，诱导效果IAA>NAA。IAA是植物中生长素的主要活性成分[12]，添加生长素IAA更有利于火龙果茎段芽增殖。

火龙果在继代培养过程中极易出现玻璃化现象，导致组培苗增殖倍数降低，生长异常。玻璃化是植物在离体繁殖过程中出现的一种形态和生理异常的状态[13]。这种异常状态对再生苗组织造成不可逆转的变化和伤害，影响再生苗的正常生长[14]，严重影响组培苗的快速繁殖。活性炭(AC)是一种性能优良的吸附剂，将适量的活性炭添加在培养基中能减少一些有害物质对组培苗的影响[15-16]。多效唑( PP333)是一种植物生长调节剂，具有延缓植物生长，抑制茎秆伸长，增加植物抗逆性，提高产量等效果[17]。本试验分别在培养基中添加AC、PP333，2种物质对火龙果组培苗玻璃化都具有抑制作用。由于AC的吸附能力不具备选择性，不仅吸附培养基中的有害物质，也会吸附营养物质，对组培苗的生长造成影响[18]。根据试验结果，PP333对抑制玻璃化促进火龙果组培苗继代增殖的效果优于AC。

4 结 论

适宜火龙果茎段灭菌及芽诱导的外植体处理方案为：选取生长1个月左右的健康火龙果茎段，去除髓部切成含1个芽眼的小段，用0.1 %HgCl2溶液灭菌10 min，将灭菌的茎段接种至MS+6-BA 4.0 mg/L培养基。适宜火龙果芽继代增殖的培养基配方为：MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L+PP333 1.0 mg/L。

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(责任编辑 汪羽宁)

Study on Stem Disinfection, Bud Induction and Proliferation ofHylocereusundatusin Vitro Culture

MOU Hai-fei1, LIU Jie-yun1, HUANG Yong-cai1, DENG Fu-bin2, WU Yan-yan1,HUANG Wei-hua1, WU Dai-dong1, LIANG Gui-dong3, HUANG Li-fang3

(1. Biotechnology Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007, China; 2. Sanya Yuanzhihai Agricultural Science and Technology Co. Ltd., Hainan Sanya 572000, China; 3. Horticultural Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007, China)

【Objective】Hylocereusundatusstem disinfection, bud induction and proliferation were explored during tissue culture to provide technical support for mass seedling production. 【Method】Taken stem ofHylocereusundatuscultivar Guihonglong No.1 as the explants, the effects of different factors on stem disinfection, bud inducement and proliferation were studied.【Result】Stem size was the main factor affecting the pollution rate of stem disinfection, followed by the effect of sterilization time and stem mature degrees. The sterilization time had the greatest influence on the bud induction, followed by the 6-BA concentration. Both the stem mature degrees and stem size had little effect on bud induction. 6-BA 4.0 mg/L had the best induction effect. The higher concentration of 6-BA showed the higher multiplication ratio of buds, but when 6-BA concentration reached 4.0 mg/L, the buds appeared vitrification. The effect of IAA was better than that of NAA, and the effect of bud proliferation was better when IAA was 0.1 mg/L. PP333 was better than AC in inhibiting vitrification and promoted subculture multiplication ofHylocereusundatus.【Conclusion】The optimal treatment for stem disinfection and bud induction was suggested as:sliced the health stems of about 1 months into pieces with single bud, and disinfected them with 0.1 % HgCl2solution, and inoculated the explants in medium of MS+6-BA 4.0 mg/L. The optimal medium for bud proliferation was MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L+PP333 1.0 mg/L.

Hylocereusundatus; Vitro culture; Disinfection; Subculture multiplication

1001-4829(2017)6-1439-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.034

2017-03-11

广西自然科学基金项目“火龙果花粉超低温保存研究”(2016GXNSFBA380107)；广西特色水果(火龙果)创新团队(nycytxgxcxtd-04-19-6)；广西农业科学院基金科研业务专项项目“火龙果茎段组织培养及快速繁殖技术研究”(2015JM31)

牟海飞(1968-)，男，广西玉林人，硕士，副研究员，主要从事作物的资源收集评价、品种选育、组培快繁、栽培等方面的研究和技术推广服务工作，E-mail:haifei5052@126.com。

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