芒果八氢番茄红素合成酶基因PSY的结构分析及功能预测

黄建峰，秦于玲，高爱平，赵志常，党志国，罗睿雄，陈业渊*

(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/国家热带果树品种改良中心，海南 儋州 571737；2.华南师范大学生命科学学院，广州 天河 510631)

芒果八氢番茄红素合成酶基因PSY的结构分析及功能预测

黄建峰1，秦于玲2，高爱平1，赵志常1，党志国1，罗睿雄1，陈业渊1*

(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/国家热带果树品种改良中心，海南 儋州 571737；2.华南师范大学生命科学学院，广州 天河 510631)

为研究芒果八氢番茄红素合成酶基因(PSY)的性质及结构功能。根据GenBank上登录的芒果及其它11种植物的PSY蛋白质氨基酸序列，利用生物信息学在线分析软件对其组成成分与理化性质、系统发育进化、导肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、二级结构、功能结构域以及三级结构进行预测和分析。结果表明，芒果与其它11种植物的PSY基因氨基酸序列的理化性质基本一致，在进化关系上划分为2类，主要表现为亲水性蛋白，α-螺旋、不规则卷曲和延伸连是其二级结构的主要结构元件，没有跨膜结构域，属于萜类合成酶C1超家族。本研究将为深入揭示PSY基因在植物花、果实和果皮以及叶片等器官颜色变化中所发挥的功能，开展其分子机理研究提供理论参考。

芒果；PSY基因；结构与功能；生物信息学

芒果(MangiferaindicaL.)素有“热带果王”之美称，是我国极具特色的热带水果[1]。色泽是果实外观品质的核心指标，其对果实及其加工产品的商品价值有重要的影响[2]。类胡萝卜素是一类脂溶性色素，它在果实中的分布十分广泛，并随种类不同，呈现无色、浅黄色、黄色、橙色到红色等不同着色类型[3]。类胡萝卜素不仅对果实色泽做出贡献，对人体而言，部分类胡萝卜素还是维生素A的前体，对保障人体健康起着重要作用[4-5]，如类胡萝卜素是一类重要的抗癌抗氧化物质[6]。因而，探求类胡萝卜素在植物体内的合成与代谢调控机制己成为植物研究领域的重要方向之一[7]。八氢番茄红素合成酶(PSY)是植物类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶，它负责催化2分子的 GGPP缩合成具有40个碳原子的八氢番茄红素，其表达对植物中类胡萝卜素的合成和积累具有重要调控作用[8]。本研究利用生物信息学的分析方法，以芒果(Mangiferaindica)PSY基因为研究对象，同时与香蕉(Musaacuminata)、甜橙(Citrussinensis)、葡萄(Vitisvinifera)、柿子(Diospyroskaki)、番茄(Solanumlycopersicum)、柚子(Citrusmaxima)、温州蜜柑(Citrusunshiu)、香瓜(Cucumismelo)以及拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)等PSY基因及相应氨基酸序列进行比对分析，预测比较它们的结构和功能差异。以期为芒果类胡萝卜素合成与代谢调控机制的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究所采用的核酸和氨基酸序列均来源于NCBI核酸及蛋白质数据库，包括芒果PSY基因(GenBank: JQ277716.1)、香蕉PSY1(GenBank: JX195663.1)、甜橙PSY(NCBI Reference Sequence: NM_001288886.1)、葡萄PSY2(NCBI Reference Sequence: XM_002271539.3)、柿子PSY基因(GenBank: FJ594485.1)、番茄PSY1基因(GenBank: KC767847.1)、柚子PSY(GenBank: KP462726.1)、温州蜜柑PSY1(GenBank: AF220218.1)、香瓜PSY(NCBI Reference Sequence: NM_001297496.1)、拟南芥PSY基因(NCBI Reference Sequence: NM_121729.2)、水稻PSY基因(GenBank: AJ715786.1)、玉米PSY基因(NCBI Reference Sequence: NM_001157573.1)。

1.2 试验方法

利用在线生物信息学分析软件和数据库对不同植物的PSY蛋白质结构和功能进行分析。核酸及氨基酸序列的相似性比对及系统进化关系采用DANMAN V6.0和MEGA 6.0软件分析；核苷酸开放阅读框的查找和翻译利用ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)在线分析软件；利用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)分析氨基酸的理化性质；蛋白质导肽的预测和可靠性分析采用TargetP 1.1 Server软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)； 跨膜结构预测利用TMHMM 2.0 Server软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；疏水性与亲水性分析采用ProtScale软件(http://web.expasy.org/protscale/)；PSY二级结构预测利用SOPMA软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)；PSY三级结构预测利用SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/interactive)；功能域预测利用NCBI CDD在线工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)；蛋白质互作网络(http://string-db.org/)。

2 结果与分析

2.1 不同植物中PSY基因核苷酸和氨基酸序列的组成成分及理化性质分析

利用NCBI的ORF Finder在线分析芒果PSY基因的核苷酸及氨基酸序列，结果表明(表1)，芒果PSY基因CDS 1296 bp，编码431个氨基酸残基。ProtParam预测结果显示，其相对分子质量为49.1 ku，理论等电点为9.07，不稳定指数为48.76，大于40，属于不稳定蛋白质，酸性氨基酸、碱性氨基酸、总带电荷氨基酸、极性氨基酸以及疏水性氨基酸的比例分别为：12.0 %、14.4 %、25.9 %、31.1 %以及45.1 %。分析结果表明：芒果与其它11种植物的氨基酸残基数及分子质量基本一致，理论等电点与香蕉、葡萄、柿子、番茄及拟南芥一样偏碱性，而其它植物的理论等电点偏酸性，含量最丰富的氨基酸芒果与玉米为Ala，其它植物均为Leu；各类氨基酸的比例芒果与其它植物均相差不大，均属于不稳定蛋白质。

表1 不同植物PSY基因核苷酸及氨基酸序列的组成成分和理化性质分析

2.2 PSY基因氨基酸序列比对分析

采用DANMAN软件对芒果及其它11种植物的PSY基因氨基酸序列进行同源性及进化关系分析。结果表明(图1)，芒果PSY基因所编码的蛋白质与甜橙PSY、柚子PSY及温州蜜柑PSY1蛋白的同源性均高达80 %，与葡萄PSY2、柿子PSY、香瓜PSY、番茄PSY1、拟南芥PSY及香蕉的PSY1蛋白同源性分别为77 %、75 %、75 %、74 %、72 %及70 %，与水稻和玉米的PSY同源性也达62 %和58 %，表明PSY在物种进化过程中是一个高度保守的蛋白。芒果PSY和其它11种植物的系统进化关系如图2所示，聚类结果显示：甜橙、柚子和温州蜜柑与芒果亲缘关系最近，而水稻和玉米亲缘最远。

图1 不同植物PSY基因的氨基酸序列同源性比较Fig.1 Homology comparison of amino acid sequences of PSY gene from different plants

图2 不同植物的PSY氨基酸序列的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequences of PSY gene from different plants

2.3 导肽的预测与分析

导肽是一段新合成肽链进入细胞器的识别序列，通常带正电荷的碱性氨基酸含量较为丰富，如果它们被不带电荷的氨基酸取代就起引导作用，说明这些氨基酸对于蛋白质的定位具有重要作用[9]。在线软件Target.P 1.1 Server对芒果及其它植物PSY基因进行导肽的预测与分析，可知芒果的导肽没有明确的定位，预测等级为5级；葡萄和番茄的导肽也没有明确定位，预测等级分别为4级和3级；除了玉米的导肽定位于线粒体内膜上，预测等级为4级外，其它植物的导肽均明显定位在叶绿体内膜上(表 2)。

表2 不同植物PSY基因导肽的预测与分析

图3 芒果PSY跨膜区域的预测Fig.3 Transmembrane domain prediction of PSY in mango

2.4 芒果PSY蛋白的跨膜结构域的预测与分析

跨膜结构域一般由约20个疏水氨基酸残基形成α-螺旋，是膜内在蛋白与膜脂相结合的主要部位，固着与细胞膜上起到锚定的作用[10]，跨膜结构域的预测和分析，对正确认识和理解蛋白质的功能、结构以及在细胞中的作用部位都有着重要的指导意义[11]。利用TMHMM 2.0 Server在线工具对芒果PSY氨基酸序列进行跨膜结构域的预测，结果表明(图3)，PSY整条肽链都位于膜外，可能不存在跨膜结构域。对其它11种植物的跨膜结构域进行预测，也得到了相似的结果。说明植物PSY蛋白在细胞质中合成前体蛋白后，没有进入其它亚细胞器，而是经过翻译后加工成为成熟的蛋白质发挥着作用。

2.5 芒果PSY基因氨基酸疏水性/亲水性的分析与预测

利用ProtScale在线工具对芒果氨基酸序列的疏水性/亲水性进行预测，结果(图4)表明，该肽链第6位点上的L疏水性最强，分值为2.300，而第53位点上的Y亲水性最强，分值为-3.333，就整体而言，亲水性氨基酸数量大于疏水性氨基酸，故推测芒果的PSY蛋白为亲水性，对其它11种植物PSY蛋白质进行类似的分析，其预测结果与芒果相似，均为亲水性的，可以推测植物PSY蛋白是亲水性的。

图4 芒果PSY氨基酸序列的疏水性/亲水性预测Fig.4 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of PSY in mango

2.6 芒果PSY蛋白二级结构的预测与分析

蛋白质二级结构主要指多肽链依赖氢键排列方向上具有周期性的结构构象，主要包括α-螺旋、无规则卷曲及延伸链和β-转角等，对其分析有助于对蛋白质空间结构的认识理解[12]。利用SOPM在线工具对芒果PSY基因的氨基酸进行分析，从图5可知，该蛋白二级结构有50.35 %的α-螺旋、26.91 %的无规则卷曲、15.55 %的延伸链、7.19 %的β-转角。纵观整个蛋白质结构发现，芒果PSY蛋白的二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲及延伸链组成。同样的方法对其它11种植物的PSY蛋白进行二级结构分析，结果表明它们在二级结构组成上比例相似，并且也都主要由α-螺旋、无规则卷曲及延伸链组成，说明PSY基因所编码的蛋白二级结构单元具有一定的相似性。

图5 芒果PSY基因氨基酸序列二级结构预测Fig.5 Secondary structure analysis of protein of PSY in mango

图6 芒果PSY蛋白质三级结构预测Fig.6 3D structure prediction of PSY in in mango

2.7 芒果PSY蛋白质三级结构的预测与分析

蛋白质三级结构是由α-螺旋、β-折叠等二级结构再折叠成一个球形的、包裹紧密的立体空间结构，可以使一级结构中2个离得远的氨基酸残基通过折叠使它们的侧链相互靠近，并通过疏水作用等构成活性位点[13]。对蛋白质三级结构的预测和分析，对理解蛋白质的结构和功能之间的关系具有一定的意义，利用SWISS-MODEL在线软件，使用同源建模的方法预测芒果PSY蛋白质的三级结构(图6)，该蛋白主要由α-螺旋、无规则卷曲及β-转角构成，与二级结构预测结果基本一致。

2.8 芒果PSY蛋白质功能结构域的预测与分析

蛋白质功能结构域是由多肽链在二级结构或超二级结构基础上，近一步折叠盘曲，形成的三级结构的局部折叠区，能独立存在于蛋白质分子中的结构功能单位[14-15]。利用NCBI Conserved Donmain分析芒果的PSY氨基酸序列功能结构域，其预测结果表明(图7)，包含有底物结合位点、Mg2+结合位点、活性位点残基、催化残基及2个天冬氨酸富集区等功能结构域，属于萜类合成酶C1超家族，对其它11种植物的功能结构域进行预测，结果与芒果一致。

2.9 与PSY蛋白质互作相关的调控网络分析

采用String数据库，以拟南芥为模型对PSY进行蛋白与蛋白相互作用进行网络分析，所构建的蛋白相互作用网络如图8所示，可以看出PSY蛋白与CRTISO、ZDS、SPS2、PDS3、ACC2、ACC1、CYP51G1、CLA1、LYC以及LUT2都有相互作用，这些蛋白也正是植物类胡萝卜素生物合成途径中的关键转录因子，至于哪些转录因子在芒果着色过程中期关键作用，还有待于后期的实验验证。

图7 芒果PSY蛋白质功能结构域预测Fig.7 Functional domains prediction of PSY in mango

图8 PSY蛋白与其它蛋白间的相互作用网络Fig.8 Interaction of PSY with other proteins

3 讨 论

生物信息学是分子生物学和信息学相结合的一门新兴学科，利用现有的公共数据库和分析工具，可以快速探索对生物大分子的结构和功能特性的认识，为后续的基础实验提供研究思路和切入点[16]。随着越来越多的植物基因组测序的完成，生命科学的研究已转变为对其基因组表达的分析以及蛋白质结构域功能预测的研究上来，继而将为代谢物合成、效应通路及其相互关系的研究提供基础。未来的几十年基因组学、代谢组学及蛋白组学势必会与生物信息学结合越来越紧密。

芒果因其富含类胡萝卜素而受到人们的喜爱，而八氢番茄红素合成酶(PSY)是植物类胡萝卜素代谢途径中的第一个类胡萝卜素合成酶，对类胡萝卜素物质的合成起到关键的作用[17]。因而研究芒果芒果类胡萝卜的代谢机制，对于芒果果实的推广利用具有重要的理论和现实意义，本文利用生物信息学方法，将NCBI上已经登录的芒果PSY基因为主要分析对象，对其与其它11种植物PSY基因的氨基酸序列进行了序列组成、理化特性、结构特点和功能等预测分析。氨基酸序列理化性质分析表明，PSY蛋白均为不稳定蛋白；同源性和系统进化分析显示，芒果PSY基因氨基酸序列与甜橙、柚子和温州蜜柑的亲缘关系最近，与水稻和玉米亲缘最远；导肽预测结果显示，芒果PSY没有明确的定位；蛋白质折叠时能形成亲水表面和疏水内核，并于潜在跨膜区出现高疏水区域[18]，本文中对芒果与其它11种植物 PSY蛋白进行疏水性/亲水性预测，结果显示PSY蛋白属于亲水性蛋白，并且不存在高疏水值区域，推测PSY蛋白可能不存在跨膜结构域，之后的跨膜结构域预测结果也证实了这一推测；蛋白质二级和三级结构分析表明，芒果与其它11种植物PSY蛋白质结构原件比例相似，主要由α-螺旋、延伸连和无规则卷曲所组成；具有底物结合位点、Mg2+结合位点、活性位点残基、催化残基及2个天冬氨酸富集区等功能结构域；STRING数据库显示PSY蛋白主要与类胡萝卜素代谢通路中一些转录因子相互作用；但PSY蛋白在芒果果实发育类胡萝卜素合成中，是通过基因本身是结构变异，还是通过组织间的功能分化，或者是通过基因间的互作以及转录因子的调控，发挥着中心调控的作用，是值得后续实验研究的。

4 结 论

利用生物信息学方法对芒果PSY蛋白序列的生理生化特性进行预测和分析，可以为PSY蛋白及其编码基因的研究提供可靠的依据；对其序列结构的预测和分析，可为其蛋白表达与修饰提供指导；对其二级结构及三级结构的预测和分析有利于深入探讨该蛋白结构与功能之间的关系、作用机制和代谢过程；本文的结论不仅能为进一步深入研究芒果PSY蛋白的功能提供参考，还可以为其它基因的生物信息学分析提供重要借鉴意义。

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(责任编辑 李山云)

StructuralAnalysisandFunctionalPredictionofPhytoeneSynthaseGenePSYinMango

HUANG Jian-feng1, QIN Yu-ling2, GAO Ai-ping1, ZHAO Zhi-chang1, DANG Zhi-guo1, LUO Rui-xiong1, CHEN Ye-yuan1*

(1.Tropic Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/National Center for Tropical Fruit Varieties Improvement, Hainan Danzhou 571737，China；2.College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou Tianhe 510631, China)

In order to study the properties and structure functions of PSY enzyme of mango, according to the nucleic acid sequences and amino acid sequences of Phytoene synthase (PSY) fromMangiferaindicaand other eleven species, several parameters of these sequences logined in GeneBank, including sequences composition, physicochemical properties, phylogenetic evolution, leader peptides, topological structures of transmembrane regions, hydrophobicity / hydrophilicity, the secondary structures, functional domains and the tertiary structures by bioinformatics tools were predicted and analyzed.The result showed that physicochemical properties of PSY inMangiferaindicaand other plants were alike. Phylogenetic analysis showed that PSY amino acid sequence of the twelve plants was classified into two classes. In all these PSY protein did not have transmembrane topological structures, and the main was a hydrophilic protein, α- helix, extended strand and random coil were the major motifs of predicted secondary structure of PSY and belonged to Isoprenoid Biosyn C1 superfamily.This work would provide a theoretical reference for studies on color variance of different plant organs, such as flowers, fruits and leaves.

Mango；Phytoene synthase gene；Structure and function；Bioinformatics

1001-4829(2017)3-0517-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.006

S667.2

A

2016-03-12

海南省重大科技项目“芒果、木薯优良种苗产业化示范与推广”(ZDZX2013023-3-02)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项“芒果种质资源7个重要亲本材料生殖生物学特性研究”(1630032015025)；农业部公益性行业(农业)科研专项“芒果产业技术研究与示范”(201203092)

黄建峰(1979-)，男，助理研究员，主要从事热带果树种质资源研究，E-mail：huangjian1984xy@163.com，*为通讯作者：陈业渊，男，研究员，主要从事热带果树种质资源研究， E-mail：chenyy1962@126.com。