低温胁迫对3种绿绒蒿生理生化指标的影响

侯祯丹，屈 燕，黄 鸿，熊 健，冷秋思

(西南林业大学园林学院/园林植物与观赏园艺省高校重点实验室，云南 昆明 650224)

【研究意义】贝利叶绿绒蒿(Meconopsisbaileyi)、多刺绿绒蒿(Meconopsishorridula)和高茎绿绒蒿(Meconopsissuperba)属罂粟科(Papaveraceae)绿绒蒿属(Meconopsis)，根据Gray Wilson (2012)最新的分类系统，分别来自Meconopsis，Grandes，Cumminsia3个属，主要生长在高海拔地区的流石滩，高海拔地区空气稀薄、气温低、温差较大、日照辐射强烈，且大风袭击使地表覆盖大量的砾石层，表面土壤稀少，其幼苗在发育早期，必须忍受高山环境寒冷多变的气候特征。因此，贝利叶绿绒蒿、多刺绿绒蒿和高茎绿绒蒿是研究高山植物在低温胁迫下生理生化变化的理想材料。 【前人研究进展】绿绒蒿属植物是云南著名的高山野生花卉，其花大、颜色丰富，具有巨大的遗传育种潜力，同时还有清热解毒、利尿、消炎、止痛等医药功效[1]。低温及低温胁迫时间的长短都会对植物体造成生理损伤，导致叶片表面呈水渍状，使叶片容易受病菌的感染或造成植物体局部坏死，影响植物的正常生长[2]。任祝三[3]对总状绿绒蒿、全缘叶绿绒蒿和粗壮绿绒蒿幼苗的生长气候进行研究，结果表明幼苗生长受气候条件影响较显著。【本研究切入点】通过人工模拟低温胁迫(4 ℃)不同时间下，对3种绿绒蒿幼苗叶片细胞的叶绿素含量、MDA含量、可溶性蛋白含量、游离脯氨酸含量及保护酶活性的变化进行分析，研究3种绿绒蒿在低温处理不同时间的生理生化指标的变化规律。【拟解决的关键问题】研究低温胁迫时间对不同绿绒蒿亚属幼苗生理生化特性的影响，为绿绒蒿属植物的引种栽培以及高山花卉植物抗低温鉴定提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以多刺绿绒蒿、贝利叶绿绒蒿、高茎绿绒蒿的半年生实生苗为材料，塑料花盆直径9 cm、高9 cm，基质为蛭石+珍珠岩+泥炭土(1∶1∶7)的混合基质。置于温度为20 ℃、湿度为75 %、光照设置为白天12 h、光照强度为120 μmol/m2·s夜间12 h、相对湿度保持在75 %～85 %的德国智能人工气候培养箱中预培养6 d，在此期间根据生长情况加入适量的水分。

1.2 试验方法

选取生长健康和长势基本一致的幼苗6株，放置在德国智能型人工气候箱内(Binder710,德国)进行低温处理。光照强度为120 μmol/m2·s，光照时间8:00-20:00时，相对湿度保持在75 %～80 %，以20 ℃进行第0小时(对照)测定，设置人工气候箱以4 ℃/h降温，降至(4.0±0.5)℃保持该温度为低温处理温度，在第24、48、72小时以及恢复20 ℃ 48 h (低温解除，记为re48 h)进行各项生理指标测定。

1.3 叶片采集

叶片样品采集时间为8:30 am，以绿绒蒿幼苗叶片的全展叶为材料，将蒸馏水洗净的叶片磨碎进行不同生理指标测定，每个指标做6个重复。

1.4 生理指标的测定

叶绿素含量的测定用分光光度法；丙二醛(MDA)测定采用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法；游离脯氨酸的测定采用磺基水杨酸法；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定。

2 结果与分析

2.1 叶绿素含量变化

由图1可知，3种绿绒蒿幼苗叶片的叶绿素含量均呈现先降后升的趋势。贝利叶绿绒蒿和高茎绿绒蒿在24 h下降幅度最大，分别为43.64 %和29.57 %，贝利叶绿绒和高茎绿绒蒿在低温处理24 h后，随着低温处理时间的延长叶片的叶绿素含量逐渐呈上升趋势；多刺绿绒蒿叶绿素含量则在48 h最低，下降幅度为23.07 %。恢复48 h后，贝利叶绿绒蒿和多刺绿绒蒿的叶绿素含量下降幅度为处理前的15.39 %和12.04 %，高茎绿绒蒿叶绿素含量上升幅度为处理前的6.71 %。

图1 低温胁迫下3种绿绒蒿幼苗叶绿素含量变化Fig.1 Changes of chlorophyll contents of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

2.2 MDA含量变化

由图2可知，3种绿绒蒿幼苗叶片MDA含量均呈先升后降趋势。低温处理24 h贝利叶绿绒蒿和高茎绿绒蒿上升较快，上升幅度分别为处理前的145.2 %和154.6 %，在低温胁迫时间24 h后，这2种绿绒蒿的MDA含量均呈下降趋势，恢复48 h后MDA的含量比处理之前高，上升幅度分别5.82 %和13.5 %；多刺绿绒蒿幼苗叶片在低温胁迫时间为72 h时MDA含量最高，上升幅度为处理之前的67.85 %。

2.3 可溶性蛋白含量变化

由图3可知，3种绿绒蒿的蛋白含量均呈先升后降趋势，贝利叶绿绒蒿和多刺绿绒蒿的叶片蛋白含量在低温处理24 h含量最高，上升幅度分别为53.82 %和103.27 %，在恢复48 h后贝利叶绿绒蒿和高茎绿绒蒿叶片可溶性蛋白含量上升幅度为处理前的11.92 % 和47.57 %；高茎绿绒蒿幼苗叶片可溶性蛋白含量处理72 h时最高，上升幅度为处理前的108.24 %，在恢复48 h后可溶性蛋白含量为处理前的47.57 %。

图2 低温胁迫下3种绿绒蒿幼苗MDA含量变化Fig.2 Changes of MDA contents of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

图3 低温胁迫下3种绿绒蒿幼苗可溶性蛋白含量变化Fig.3 Changes of soluble protein contents of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

图4 低温胁迫下3种绿绒蒿幼苗SOD活性变化Fig.4 Changes of SOD activity of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

2.4 SOD活性变化

由图4可知，3种绿绒蒿幼苗叶片SOD活性均呈现先升后降的趋势。高茎绿绒蒿幼苗叶片的SOD活性比较高，贝利叶绿绒蒿和多刺绿绒蒿的SOD活性较低；在低温处理24 h时，贝利叶绿绒蒿和多刺绿绒蒿SOD活性最强，上升幅度分别为处理前的 159.16 % 和9.18 %，在低温处理48 h后贝利叶绿绒蒿SOD活性迅速下降，贝利叶绿绒蒿和多刺绿绒蒿恢复48 h后SOD的活性均比处理前低，下降幅度为13.82 %和59.88 %；而在低温处理48 h时，高茎绿绒蒿幼苗叶片SOD活性最强，上升幅度为处理前的79.78 %，之后随低温胁迫时间的延长呈下降趋势，在低温胁迫恢复48 h时，下降幅度为低温处理前的6.15 %。

2.5 游离脯氨酸含量变化

由图5可知，3种绿绒蒿幼苗叶片游离脯氨酸含量均呈现先升后降的趋势，在低温胁迫24 h贝利叶绿绒蒿和高茎绿绒蒿幼苗叶片游离脯氨酸含量上升幅度较快，上升幅度是处理前的118.75 %和445.13 %，到48 h后游离脯氨酸的含量呈下降趋势，恢复48 h后游离脯氨酸的含量比低温处理前低，下降幅度分别为4.17 %和41.59 %；而多刺绿绒蒿幼苗在低温处理48 h前呈现上升趋势，低温处理48 h时上升幅度为140 %，之后叶片中游离脯氨酸含量开始下降，恢复48 h后游离脯氨酸含量上升幅度为处理前27.5 %。

图5 低温胁迫下3种绿绒蒿幼苗游离脯氨酸含量变化Fig.5 Changes of free proline contents of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

3 讨 论

3.1 低温胁迫时间与叶片叶绿素含量

叶绿体是植物进行光合作用的主要场所，逆境胁迫下部分光合机制遭到破坏，植物体内的叶绿素含量为适应逆境环境而产生生理变化[4]。光合作用是植物能量转化的来源，植物对低温最敏感的器官是光合器官，低温又影响叶绿素的合成，更造成叶绿素降解加强，导致植物幼苗的光合减弱。张雪[5]研究发现，低温下叶片内叶绿素含量略有增加，可能是由于叶绿素形成的最低温度是2～4 ℃；张学财[6]等的研究发现在4 ℃处理时，3种剑麻品种叶绿素含量先降后升，这也可能是机体对低温环境逐步适应的表现。本研究中3种绿绒蒿幼苗叶片在低温胁迫下叶绿素含量均呈先降后升的趋势，贝利叶绿绒蒿和高茎绿绒蒿幼苗叶片处理24 h叶绿素含量先大幅度下降再逐渐上升，多刺绿绒蒿处理48 h缓慢降到最低随后上升，说明在低温处理初期绿绒蒿幼苗叶片无法进行光合作用，导致幼苗无法合成叶绿素并开始降解，故叶绿素含量降低；随后叶绿素含量逐渐上升，说明在持续4 ℃的低温下，低温没有使叶绿素合成受到破坏，而是限制了叶绿素的合成。贝利叶绿绒蒿和高茎绿绒蒿幼苗叶片叶绿素含量处理24 h时最低，随后叶绿素含量递增，而多刺绿绒蒿处理48 h时叶绿素含量最低，而后逐渐升高，说明贝利叶绿绒蒿和高茎绿绒蒿在低温处理下能更快速地对低温逆境胁迫做出反应。

3.2 低温胁迫时间与MDA含量

植物器官在低温逆境条件下，会发生膜脂过氧化作用产生MDA。植物细胞质膜损伤的程度由MDA含量的变化反应，MDA在一定程度上也反映了植物抗逆性的强弱，叶片中MDA积累越少，膜质过氧化程度小，表明组织的抗逆性越强。田丹青[7]的研究发现，低温处理12 h 后3个红掌品种叶片的 MDA 含量均呈降低的趋势，MDA含量随着低温处理时间的延长而增加，这与相对电导率的测定结果以及冷害症状表现一致。张玲丽[8]的研究发现14个百合品种在低温胁迫1～3 d后所有百合品种MDA含量都有不同程度的升高，低温胁迫3 d后，各品种的MDA含量呈极显著差异。本研究低温胁迫3种绿绒蒿的叶片MDA含量均呈现先升后降的趋势，贝利叶绿绒蒿和高茎绿绒蒿幼苗在低温胁迫24 h MDA含量呈先大幅上升再缓慢下降的变化趋势，表明细胞膜系统受到损伤，保护酶清除速率低于活性氧产生速率，积累大量活性氧，导致膜质过氧化作用更加剧烈，MDA含量快速增加，严重阻碍了保护酶活性并降低抗氧化物的含量[9]，迫使细胞膜系统损伤更加严重[10]；多刺绿绒蒿幼苗叶片MDA含量随低温胁迫时间的延长呈上升趋势且增幅小，说明其在低温逆境条件下，膜质过氧化程度小，表明多刺绿绒蒿幼苗叶片组织的抗逆性强。贝利叶绿绒蒿和高茎绿绒蒿幼苗叶片处理24 h时MDA含量最高，随后呈递减趋势，多刺绿绒蒿处理72 h 时MDA含量最高，且多刺绿绒蒿MDA含量增幅小。

3.3 低温胁迫时间与可溶性蛋白含量

在逆境环境下植物通过可溶性物质的积累来调节渗透，可溶性蛋白含量的变化反应了植物合成和代谢能力，低温条件下，可溶性蛋白含量的增加，有助于加强细胞的保水能力，从而提高植物体的抗寒性。抗寒性强的品种可溶性蛋白含量高，在低温逆境环境中可溶性蛋白含量呈上升趋势[11]。沙伟[12]等的研究发现在低温胁迫下扎龙芦苇叶片内可溶性蛋白的含量明显下降，但仍高于对照组。在低温胁迫下抗寒性强的葡萄品种可溶性蛋白含量高且增加幅度大[13]；在低温胁迫下随温度的降低芸香可溶性蛋白含量增加[14]；抗寒性强的葡萄品种可溶性蛋白形成早且含量高[15]。杨慧菊[16]等研究发现低温胁迫下马铃薯幼苗的可溶性蛋白含量不断上升。本研究贝利叶绿绒蒿和高茎绿绒蒿幼苗叶片在恢复48 h后可溶性蛋白含量下降，但仍高于处理前含量，细胞的持水力由可溶性蛋白的亲水胶体性决定，可溶性蛋白含量的增加可以约束更多的水分，减少原生质因结冰而伤害致死的机率。贝利叶绿绒蒿和多刺绿绒蒿幼苗处理24 h可溶性蛋白含量最低，随低温胁迫处理时间延长可溶性蛋白呈下降趋势，说明抗寒能力弱，而高茎绿绒蒿幼苗叶片内可溶性蛋白含量随着低温处理时间的延长明显上升，处理72 h可溶性蛋白含量最高，说明低温处理后高茎绿绒蒿幼苗叶片内可溶性蛋白可能是从膜上或其它的结合形式中降解释放的，也可能是有新的蛋白质合成。

3.4 低温胁迫时间与SOD活性

在植物体内多种酶维持活性氧在动态平衡的低水平，是植物对低温逆境胁迫的初始反应。超氧化物阴离子自由基产生的H2O2和O2可以被SOD清除，从而防止活性氧过多积累对植物体造成伤害来维持活性氧的动态平衡。张尚雄等[17]研究表明3个披碱草属牧草随低温胁迫的增强叶片SOD活性急剧增加，表明3个披碱草属牧草受到寒冷胁迫时产生了氧自由基以抵御寒冷。本研究低温胁迫下3种绿绒蒿SOD活性均呈现先升后降的趋势，持续低温胁迫诱导激发了酶的活性使酶活性增强，从而提高植物体细胞抗寒性，由于环境温度过低导致酶的活性下降，从而使植物体细胞结构遭到破坏，活性氧被保护酶系统清除的能力下降，活性氧大量积累致使膜系统结构和功能受到破坏。贝利叶绿绒蒿和多刺绿绒蒿幼苗叶片SOD活性处理24 h活性最强，而高茎绿绒蒿处理72 h活性最强，增幅最大。

3.5 低温胁迫时间与游离脯氨酸含量

游离脯氨酸是渗透胁迫下产生的渗透调节物质，能保护植物体细胞内生物大分子、稳定细胞蛋白质结构及保持氮含量的作用[18]。王静[19]等研究认为，脯氨酸含量与植物抗寒性关系密切，低温胁迫程度增加会使游离脯氨酸含量增加。邓雪珂等[20]研究表明，紫花苜蓿随低温处理时间的延长游离脯氨酸含量大幅增加，在低温胁迫12 h后游离脯氨酸含量增加十分显著。罗新义等[21]发现，随低温处理时间的延长肇东苜蓿叶片中游离脯氨酸含量逐渐增加。本研究低温胁迫下3种绿绒蒿幼苗叶片游离脯氨酸含量均呈现先升后降的趋势，贝利叶绿绒蒿和高茎绿绒蒿在处理24 h时游离脯氨酸的积累达到峰值随后下降，有可能是超过渗透调节能力范围造成的生理损伤反应；多刺绿绒蒿随低温处理时间的延长呈上升趋势，在处理48 h时达到峰值，游离脯氨酸的积累可能对植物体内渗透调节起到了作用。高茎绿绒蒿在处理24 h时游离脯氨酸含量较其它两种绿绒蒿增幅大。

4 结 论

通过比较3种绿绒蒿在低温胁迫下，其生理生化指标对低温的响应规律，发现3种绿绒蒿均具有一定的抗寒性，而高茎绿绒蒿较之其它两种的抗寒能力更强。研究结果可为今后绿绒蒿属植物杂交育种、抗寒基因筛选等工作提供参考。