马来西亚链霉菌ECO 00002产Azalomycin F发酵条件优化

张 庆，白亭亭，李铭刚，何 翔，徐胜涛，倪 明 ，番华彩，曾 莉，杨佩文*

(1.云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南 昆明 650205；2.云南大学，云南 昆明 650091；3.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201)

【研究意义】 杨佩文等针对马来西亚链霉菌S.malaysiensisECO 00002活性化合物分离及结构分析显示，该菌株活性部位主要含两种结构类似的同系化合物，经HPLC制备纯化，并通过详细的1H和13C NMR数据测定及文献对比分析，确定活性化合物为阿扎霉素F3和F4[1]。前期生物活性测定结果表明，其对多种植物病原真菌有较强的抑菌活性[2]。然而前期研究表明，该活性化合物产量较低，难以满足工业化生产的需要，限制了对它的进一步研究和开发利用。【前人研究进展】阿扎霉素 F类化合物最早于1959年由Arai从吸水链霉菌阿扎霉素变种(S.hygroscopicusvar.azalomyceticus) 中分离得到，主要成分为3 个36 元多羟基大环内酯化合物阿扎霉素 F5a、F4a和 F3a[3-5]，目前报道的该类化合物约30个[6-7]。阿扎霉素 F类化合物具有高效广谱抗植物病原真菌活性，小鼠(mouse)口服LD50为300～580 mg/kg，大鼠(rat)口服LD50为980 mg/kg，其毒性分级为低毒III级，具备开发为防治作物真菌病害的低毒高效农用抗生素的潜力[8]。【本研究的切入点】根据该菌株生长特性和活性化合物阿扎霉素F合成的条件需求，优化发酵培养基和发酵条件，创造适合菌株生长和目标活性化合物合成的最佳条件，充分发挥菌种的生产潜力，是提高菌株发酵水平和降低生产成本的有效途径[9-10]。【拟解决的关键问题】本研究以提高马来西亚链霉菌ECO 00002的阿扎霉素F产量为目标，在对菌株种子培养条件优化的基础上，重点考察碳氮源对目标活性化合物生物合成的影响，筛选适宜的碳氮源，优化其配比，并进一步优化菌株发酵条件，为菌株发酵工艺产业化提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株

云南大学微生物研究所保藏菌种马来西亚链霉菌S.malaysiensisECO-00002。

1.2 培养基

基础培养基：酵母膏4 g，葡萄糖4 g，麦芽膏5 g，复合维生素(维生素B11 mg，维生素B61 mg，核黄素1 mg，烟酸1 mg，苯丙氨酸1 mg，生物素1 mg，丙氨酸0.3 mg)，微量盐(FeSO4·7H2O20 mg，MnCl2·2H2O 10 mg，ZnSO4·7H2O10 mg)，琼脂20 g，水1000 mL，pH 7.5，制作平板和试管斜面。液体种子培养基：葡萄糖14.5 g，酵母膏15 g，麦芽膏20 g，CaCO33 g，MgSO4·7H2O 1 g，MnSO4·4H2O 0.1 g，KH2PO40.2 g，水1000 mL，pH 7.5。PB试验和RSM试验培养基：采用STATISTICA 6.0进行试验设计，并配制相应培养基，培养基于1×105Pa下灭菌20 min。

1.3 PB和RSA试验方法

采用PB设计考察主要的碳氮源成分对阿扎霉素F产量的影响，筛选适宜的碳氮源；在此基础上，采用RSA法优化适宜碳氮源的比例。具体方法：将供试菌株接种于斜面试管培养基上，然后置于28 ℃恒温条件下培养120 h。再用灭菌蒸馏水洗下菌体，并按照10 % 的接种量接入装有100 mL 种子培养基的500 mL 三角瓶中，28 ℃下200 r/min 振荡培养至48 h。再取种子液10 mL接种于装有100 mL发酵液(PB培养基和RSA培养基)的500 mL三角瓶中，于28 ℃下200 r/min振荡培养72 h，测定阿扎霉素F的含量。

1.4 发酵条件优化试验方法

在培养基优化的基础上，采用单因素试验进行温度、起始pH、发酵瓶装液量、接种量、发酵时间等发酵条件对阿扎霉素F产量的影响试验。温度设置24 ℃，28 ℃，32 ℃，36 ℃等4个梯度；pH值设置6.0，6.5，7.0，7.5，8.0等5梯度；装液量设置50 mL/500 mL，75 mL/500 mL，100 mL/500 mL，125 mL/500 mL等4梯度；接种量设置2 %，4 %，6 %，8 %，10 %等5个梯度；发酵时间设置8，16，32，40，48，64，72，80，88，96，104 h等11个梯度。测定各试验阿扎霉素F的含量。

1.5 发酵罐放大发酵试验方法

利用50 L自动生物发酵罐验证菌株扩大培养的发酵条件。将发酵罐内外全面清洗干净，检查发酵罐的密闭性。用标准pH缓冲液对罐体上的pH监测探头进行校准。装入配制好的优化培养基25 L，关闭发酵罐顶盖。通过发酵罐控制面板设定灭菌程序灭菌30 min。待温度冷却后，通过火焰圈接种法按10 %接种量接种。设定发酵参数：搅拌转速150 r/min，温度28 ℃，通气量60 L/min，进气压力1.0 bar、罐内压0.3 bar。从24 h后开始定时取样，取样量为50 mL，测定菌体体积和阿扎霉素F的含量。

1.6 分析方法

菌体体积测定：将所取发酵液10 mL装到带刻度的试管中，静置12 h后测量菌丝沉降体积。阿扎霉素F含量测定：取发酵液50 mL，进样于经过预处理的大孔树脂层析柱，然后分别用甲醇∶水体积比为6∶4、7∶3、10∶0的洗脱液梯度洗脱，HPLC测定10∶0洗脱部分阿扎霉素F含量。HPLC系统采用Waters 515二元高压泵，2966PDA检测器，Hanban C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，柱温30 ℃，流动相为甲醇∶水(8∶2)，检测波长241.0 nm，进样量20 μl，流速1.0 mL/min，分析时间20 min。含量根据色谱峰面积与标准品的峰面积对比进行计算。

2 结果与分析

2.1 PB试验结果与分析

采用STATISTICA 6.0软件进行PB试验设计，对发酵培养组成中的葡萄糖、淀粉、酵母膏、大豆粉、NaCl、K2HPO4等6个因素进行筛选，每个因素设高低2个水平，实验设计与结果如表1～2所示。

由回归分析可知，大豆粉和葡萄糖是主要的影响因素，二者在大于95 %的概率水平上差异显著。淀粉、酵母膏、NaCl、K2HPO4等4个因素在95 %的概率水平上差异不显著，由此确定大豆粉和葡萄糖为主要因素进行下一步实验。

2.2 RSA试验结果与分析

在PB实验回归分析基础上，采用STATISTICA 6.0软件进行RSA试验设计，对葡萄糖和大豆粉的配比进行优化，实验设计及结果如表3～4和图1所示。

试验结果表明：各因素之间有一定交互作用，二次方模型与上述结果的拟合较好(模型的R2>0.98)。各因素优化的比例为葡萄糖1.59 %，大豆粉2.90 %。

表1 发酵培养基碳氮源筛选PB试验设计与结果

表2 发酵培养基中的碳氮源筛选试验统计分析结果

表3 碳氮源浓度响应面试验设计及阿扎霉素产量测定结果

表4 碳氮源浓度响应面试验统计分析结果

图1 响应面分析法确定响应最大值Fig.1 The maximum response value determined by RSA test

2.3 发酵条件优化试验结果与分析

菌株发酵条件优化结果表明(表5)：发酵温度在24～36 ℃，随着温度提高阿扎霉素F HPLC效价先提高后下降，28 ℃时效价为最高。发酵培养基初始pH在6.0～8.0，随着pH升高阿扎霉素F HPLC效价先提高后下降，7.5时效价为最高。在500 mL三角瓶装液量为50 mL时阿扎霉素F HPLC效价最高，随着装液量的增加效价逐渐下降；接种量分别以2 %、4 %、6 %、8 %、10 %接种，随着接种量的增加阿扎霉素F HPLC效价逐渐提高。综合考虑装液量、通气量和生产成本，适宜装液量为100 mL/500 mL，接种量为10 %。阿扎霉素F在0～16 h时间段没有合成，而在24～72 h时间段内大量合成，并在72 h时HPLC效价达到最高值，之后逐渐下降，因此，确定菌株的发酵终点定为72 h。

表5 发酵条件优化结果

将一级种子接种到优化后的发酵培养基，于优化的培养条件下发酵培养。不同时间取样，测定阿扎霉素F HPLC效价、菌丝生物量及pH，试验结果表6所示。48 h前，菌体处于指数生长期，发酵液pH一直下降；48 h后，菌体生长进入稳定期，阿扎霉素F合成速度加快，在72 h HPLC效价达最高，为1950.26 μg/mL。随着时间延长，阿扎霉素F HPLC效价呈下降趋势，88 h发酵液pH值急剧上升，显微镜检察发现菌体自溶。在优化的发酵条件下，阿扎霉素F HPLC效价由原来的637.59 μg/mL上升到1950.26 μg/mL，HPLC效价提高约205.88 %(P<0.01)。

2.4 发酵罐放大发酵试验结果与分析

50 L自动生物发酵罐验证优化条件试验过程中，各阶段阿扎霉素F含量和菌丝体沉降体积变化情况如表7所示。从上罐至18 h，菌体开始生长，整个过程中菌丝体积的变化呈现平缓增加的趋势，阿扎霉素F从24 h时开始产生，到63 h时达到最高效价，为2094.12 μg /mL。

表7 发酵过程中阿扎霉素F和菌丝沉降体积结果

3 讨 论

3.1 阿扎霉素 F类化合物农抗应用前景及存在问题

阿扎霉素F是一类含氧杂环的大环内酯类化合物，文献报道从S.hygroscopicusvar.azalornyceticus、S.hygroscopicusA1491、S.violaceusnigerRS-22、S.hygroscopicusMSU/IVIIV-4-75B、Actinomycetesp. HILY-9120362、S.malaysiensisECO-00002、S.malaysiensisMJM1968J 及S. sp. 211726等多种链霉菌的发酵产物中先后发现了该类化合物，具有显著的抗真菌、革兰氏阳性菌和抗肿瘤活性，具备开发为高效农用抗生素的潜力，但由于缺乏系统成药基础研究，导致下游开发形成瓶颈，截止目前尚未作为农用抗生素在国内登记使用[11-17]。马来西亚链霉菌ECO 00002分离自云南省宁蒗县土壤样品产阿扎霉素新的野生型菌株，产率相对较低，通过选育优良菌株或利用基因工程技术构建高产菌株，结合现代发酵工程和代谢工程技术，优化菌株定向发酵调控工艺，提高活性化合物阿扎霉素F的生产率，是实现产业化开发的主要途径。本研究结果表明，通过发酵条件优化，可以显著提高目标活性化合物阿扎霉素F的产率，而选育优良菌株或利用基因工程技术构建高产菌株是下一步需要重点开展的研究内容。

3.2 阿扎霉素 F类化合物代谢调控的阐明对于菌株选育、遗传改良和发酵优化的指导作用

阐明阿扎霉素F类化合物的形成遗传机制和生物合成过程是菌株选育和遗传改良的基础，也是菌株发酵条件优化的前提。阿扎霉素F类化合物的生物合成是在复杂的调控系统的调控作用下完成，调控因子通过不同的机制发挥其全局调控的作用[18]。因此，通过调节正调控因子可以提高化合物的产率，抑制负调控因子可以解除对化合物合成的抑制作用而实现提高产率的目的。阿扎霉素F系含氧杂环的大环内酯类化合物，其生物合成是由包括酰基辅酶A活化羧酸等一系列多次重复的醇醛缩合反应，催化形成具有一定长度的聚酮链骨架，然后该聚酮链骨架经过环化，或者与脱氧糖等结构单元连接而形成[5]。阿扎霉素B的生物合成机制是最先被阐明的阿扎霉素类化合物，该化合物具有一个非常稀有的C-2对称结构，属于16元环大环内酯类化合物，其碳骨架主要来源于6个丙酸盐、8个乙酸盐和2个丁酸盐，利用头尾缩合式的聚酮类化合物的合成方式合成，其中包括来源于葡萄糖的2-脱氧岩藻糖，来源于丙酸盐的3个甲基基团，结构中糖苷配基中的氧原子来源于聚酮生物合成过程中的前体物质[19]。而阿扎霉素F系列化合物的研究主要集中在活性测试和结构鉴定等方面，生物合成机制尚未完全明确[20]，化合物代谢调控的阐明对于菌株选育、遗传改良和发酵优化的将具有重要的指导作用。

3.3 发酵条件优化对于阿扎霉素 F类化合物生物合成的影响

无机盐、微量元素、生长因子、前体和抑制剂等培养基组成也是菌体生长繁殖和目标活性化合物的生物合成的重要影响因素。从阿扎素F类化合物生物合成途径及与其相关的代谢途径出发，筛选促进化合物生物合成的影响因素是提高产率的另一重要途径。

4 结 论

马来西亚链霉菌ECO 00002发酵培养基中主要的影响因素为大豆粉和葡萄糖，其最大响应值分别为2.90 %和1.59 %；优化的发酵条件为初始pH 7.5，装液量100 mL/500 mL，接种量为10 %，发酵温度28 ℃，发酵时间72 h。在优化的发酵培养基和发酵条件下，摇瓶水平上阿扎霉素F HPLC效价由原来的637.59 μg/mL上升到1950.26 μg/mL，HPLC效价提高率为205.88 %(P<0.01)；100 L发酵罐阿扎霉素F的HPLC效价为2094.12 μg /mL，阿扎霉素F类化合物的HPLC效价大幅度提高。