表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对血液胰岛素和胰高血糖素的影响

黄业伟，高 晨，颜 平，张 蒙，张冬英，吴晓云

(1.云南农业大学食品科技学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学普洱茶学教育部重点实验室，云南 昆明 650201；3.云南省茶深加工工程技术研究中心，云南 昆明 650201)

【研究意义】胰岛素(INS)发展至今已有近百年的历史，胰岛素治疗是目前公认的最有效的糖尿病核心疗法，它是降血糖的唯一激素[1-2]。糖尿病患者经过有效安全的胰岛素治疗后，血糖可以长期达标，糖尿病并发症发病几率显著降低，这对提高患者生活质量与延长寿命具有至关重要的作用[3-5]。但是，现在许多糖尿病患者不良的饮食和生活习惯导致血糖水平控制不佳，影响胰岛素药物治疗效果，甚至引起糖尿病并发症的产生。而对于有喝茶习惯的糖尿病病人，喝完茶后是否会影响血液中胰岛素水平，从而减弱胰岛素治疗效果，目前还没有确切的结论。【前人研究进展】黄业伟等研究发现，茶多酚和儿茶素类物质具有多个酚羟基结构的化合物，易与疏水性物质结合，例如咖啡因、脂类等[6]。王素敏等研究发现氧化型茶多酚能与体内脂质结合，抑制肠道对其吸收，增加粪便脂类的排出[7]。Shan等在以SD大鼠为对象研究发现，普洱茶中的主要茶多酚物质——氧化型茶多酚可以与阿替洛尔结合形成复合物，从而抑制机体对阿替洛尔的吸收，并促进其从粪便中排出，进而影响药物的治疗效果[8]。卢浩等曾用普洱茶中的氧化型茶多酚对食用黄曲霉毒素饮食的SD大鼠进行长期治疗后，氧化型茶多酚能够与黄曲霉毒素B1结合形成复合物，从而抑制黄曲霉毒素B1的吸收，进而抑制其对肝脏的毒性[9]。【本研究切入点】EGCG作为茶叶中儿茶素的主要成分，也具有多个酚羟基结构，表明EGCG也易与疏水物质结合；胰岛素蛋白的表面具有疏水性位点，其与EGCG之间是否会发生相互作用，从而阻碍血液中胰岛素发挥药效，此方面研究报道甚少。【拟解决的关键问题】研究EGCG是否会影响血液中胰岛素和胰高血糖素的检测，以及饮用茶是否会影响糖尿病病人血液中的胰岛素和胰高血糖素水平，对于有饮茶习惯的糖尿病人具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，纯度>98 %，成都普瑞法科技开发有限公司)；链脲佐菌素(美国，Sigma)；一水合柠檬酸(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；柠檬酸钠酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；肝素钠(上海，北京鼎国生物科技有限责任公司)；抑肽酶(上海，bovinelung，上海邦景实业有限公司)；胰岛素试剂盒(美国，Crystal chem)；胰高血糖素试剂盒(美国，Crystal chem)。

1.2 主要仪器

Multiskan Mk3型酶标仪(Thermo，美国)；SK-18TC型超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司，中国)；超纯水机(普力菲尔理化检测型)；血糖仪(三诺，中国)；磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)；电子天平(北京多利斯仪器系统有限公司)；小型台式高速离心机(HITACHI，日本)；4 ℃生物药品柜(海尔，中国)；掌上离心机(TOMY公司，日本)；-80 ℃超低温冰箱(海尔，中国)；移液枪 (吉尔森、Eppendorf)；制冰机(三洋电机，中国)。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂盒检测方法 从4 ℃冰箱取出胰岛素(型号90080，美国Crystal chem)和胰高血糖试剂盒(型号81504，美国Crystal chem)，于室温平衡30 min。胰岛素试剂盒使用方法：配制胰岛素标准品，向96孔板中加入5 μl的样品和标品后再向每孔加入95 μl的样品稀释液，贴膜4 ℃孵育2 h，洗板6次后加入100 μl酶共轭稀释剂后室温孵育1 h。最后洗板6次，加入100 μl显色液TMB 30 min后终止反应，利用酶标仪测450 nm和630 nm的吸光度值。

胰高血糖素试剂盒使用方法：配制胰高血糖素标准品，向96孔板中加入50 μl的样品和标品后再向每孔加入50 μl的标记抗原，贴膜4 ℃孵育44～48 h，洗板3次后加入SA-HRP溶液，贴膜，摇床上室温孵育1 h，洗板3次加入100 μl显色液OPD Tablet 20 min后终止反应，利用酶标仪测490和630 nm的吸光度值。

1.3.2 EGCG对胰岛素和胰高血糖素含量测定的影响 在体外实验中，向装有正常大鼠血液的离心管中分别加入胰岛素与胰高血糖素，随后分别加入不同浓度的EGCG。EGCG对胰岛素含量的测定有6个处理，处理1：EGCG 2 mg/mL +胰岛素20 ng/mL、处理2：EGCG 1 mg/mL +胰岛素20 ng/mL、处理3：EGCG 0.5 mg/mL +胰岛素20 ng/mL、 处理4：EGCG 0.25 mg/mL +胰岛素20 ng/mL、 处理5：EGCG 0.125 mg/mL +胰岛素20 ng/mL、处理6：胰岛素20 ng/mL。分别与胰高血糖素2000 pg/mL在相同时间内混匀通过高速离心相互作用，最后用胰岛素试剂盒和胰高血糖素试剂盒进行含量的测定。

1.3.3 STZ糖尿病SD大鼠模型建立 将SD大鼠随机分组，动物饲养于云南农业大学动物实验中心标准大鼠饲养室，动物自由进食、饮水，开始实验前动物适应环境2周。造模前动物禁食12～16 h，次日早上测空腹体重，空腹血糖。提前制备柠檬酸缓冲液，称取链脲佐菌素STZ，并将其溶于柠檬酸缓冲液中。注射时用柠檬酸缓冲液以1 % 的浓度溶解STZ，0.22 μm滤膜过滤消毒。按空腹体重55 mg/kg腹腔注射相应的链脲佐菌素(STZ)，在30 min内注射完毕[10]。连续注射3～5 d，监测血糖情况，空腹血糖浓度高于11.6 mmol/L 视为建模成功。

1.3.4 EGCG对STZ糖尿病SD大鼠的影响 将建模完成的糖尿病大鼠随机分成4组：EGCG+INS联用组、INS组、EGCG组及对照组，称重。EGCG+INS联用组、EGCG组按100 mg/kg体重灌胃EGCG，其他组灌胃相应体积的生理盐水，15 min后EGCG+INS联用组、INS组皮下注射胰岛素1 U/kg体重，其他组皮下注射相应体积的生理盐水。每隔30 min(持续到120 min)对大鼠进行眼底静脉丛采血1 mL，注入加入抑肽酶10 μl的采血管中，离心制备血浆。取相应的血浆，利用试剂盒对血液中的胰岛素和胰高血糖素水平进行测定。

1.4 数据分析

数据分析采用Excel软件，利用4-PL分析计算出胰高血糖素、胰岛素的含量。利用SPSS 17.0对数据进行显著性分析。

图1 EGCG对胰岛素含量检测的影响Fig.1 Effect of EGCG on the detection of insulin

2 结果与分析

2.1 EGCG对胰岛素和胰高血糖素检测的影响

2.1.1 EGCG对胰岛素含量检测的影响 胰岛素作为一个重要的激素，对人体血糖具有调节作用。通过体外实验研究EGCG对胰岛素检测的影响。如图1所示，血液中不同浓度EGCG(浓度范围为0～2 mg/mL)与胰岛素混合后，所有EGCG处理组(处理1～5)与单独胰岛素组(CK)相比，没有显著性差异，这说明EGCG不会干扰胰岛素水平的检测。

2.1.2 EGCG对胰高血糖素含量检测的影响 如图2所示，血液中不同浓度EGCG(浓度范围为0～2 mg/mL)与胰岛素混合后，结果显示，低浓度的EGCG组(处理3～5)与胰高血糖素组(CK)之间胰高血糖素含量没有显著差异，而高浓度的EGCG组(处理1～2)中胰高血糖素含量要比胰高血糖素组(CK)显著升高。这表明高浓度的EGCG会影响对胰高血糖素的检测，为了保证血液中胰高血糖素检测的准确性，后续试验中血液EGCG的浓度不得高于1 mg/mL。

与CK相比，*为P<0.05Compared with the control group, * means P<0.05图2 EGCG对胰高血糖素含量检测的影响Fig.2 Effect of EGCG on the detection of exogenous glucagon

与对照组比较，* 表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001Compared with the control group, * means P<0.05, ** means P<0.01, *** means P<0.001图3 糖尿病模型大鼠血糖变化Fig.3 Changes of blood glucose in diabetic rats

2.2 糖尿病大鼠的血糖及体征变化

SD大鼠作为实验动物模型，用链脲佐菌素(STZ)诱导成胰岛素缺乏型的糖尿病动物模型。糖尿病动物模型成功的判断标准是随机血糖大于11.6 mmol/L[11]。图3显示STZ建模组在注射后第3天的时候，血糖开始逐渐上升，到第9天血糖值已达标准，这说明已经建模成功。同时发现这些建模成功的大鼠体重明显减少，并出现多饮、多食、多尿的症状。

2.3 EGCG对STZ糖尿病大鼠的血糖影响

将EGCG 100 mg/kg (相当于血液中浓度低于1 mg/mL)的剂量给糖尿病鼠灌胃(模拟糖尿病病人饮用茶)，以15 min/次灌胃持续120 min，测定血糖。结果如图4所示，胰岛素组与对照组相比，EGCG组与胰岛素组相比，联用组与对照组相比，EGCG组与联用组相比，各个时间点血糖水平差异极显著。而EGCG组与对照组相比，血液中的血糖并没有显著改变；EGCG+INS联用组与INS组相比，在各个时间点上降血糖效果差别不显著。以上结果表明，EGCG灌胃糖尿病大鼠，不影响胰岛素注射对机体的影响，对机体无降血糖作用。

对照组与胰岛素组比较，&表示P<0.05，&&表示P<0.01，&&&表示P<0.001；EGCG组与胰岛素组比较，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001；对照组与联用组比较，$表示P<0.05，$$表示P<0.01，$$$表示P<0.001；EGCG组与联用组比较，^表示P<0.05， ^^表示P<0.01，^^^表示P<0.001。图4 EGCG对糖尿病大鼠血糖的影响Fig.4 Effect of EGCG on blood glucose in diabetic rats

对照组与胰岛素组比较，&表示P<0.05，&&表示P<0.01，&&&表示P<0.001；EGCG组与胰岛素组比较，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001；对照组与联用组比较，$表示P<0.05，$$表示P<0.01，$$$表示P<0.001；EGCG组与联用组比较，^表示P<0.05， ^^表示P<0.01，^^^表示P<0.001。图5 EGCG对血液胰岛素含量的影响Fig.5 Effect of EGCG on serum insulin content

2.4 EGCG对STZ糖尿病大鼠血液激素水平的影响

2.4.1 EGCG对血液中胰岛素含量的影响 胰岛素和胰岛素受体结合，激活胰岛素下游信号通路，促进糖原合成及全身组织对葡萄糖的摄取和利用，并抑制糖原的分解和糖原异生，从而起到降血糖作用[12]。如图5所示，对血液中胰岛素含量进行检测，EGCG组与对照组比较没有显著性的差异。由于EGCG+INS联用组与INS组中有外源的胰岛素注入，所以血液中胰岛素含量比较高；而EGCG+INS联用组与INS组相比，在各个时间点都没有显著差异，这表明EGCG干预不会引起血液中胰岛素水平变化，对胰岛素的降血糖效果无影响。

2.4.2 EGCG对血液中胰高血糖素含量的影响 胰高血糖素可以促进糖原分解和糖异生，使血糖明显升高，这是影响血糖的重要因素[13-14]。如图6所示，EGCG+INS联用组、INS组、EGCG组及对照组在各个时间点的胰高血糖素的含量没有显著性差异，这表明EGCG不会影响糖尿病大鼠血液中胰高血糖素水平。

3 讨 论

胰岛素及胰高血糖素是调节人体血糖平衡的主要激素，在维持其稳态确保血糖在正常水平非常重要。EGCG作为茶叶中的主要成分，山云等研究发现，茶叶中多酚类物质有强吸附能力，对药物的药效有减弱的作用[8]。而EGCG作为茶多酚中主要成分，对于有饮茶习惯的糖尿病人，是否会影响其治疗效果，目前尚无研究报道。

图6 EGCG对血液胰高血糖素含量的影响Fig.6 Effect of EGCG on serum glucagon content

文章首先检测了不同浓度的EGCG对血液中的胰岛素和胰高血糖素含量的影响，以确定合适的EGCG浓度对糖尿病大鼠进行灌胃。其次通过模拟饮茶方式，对糖尿病大鼠进行EGCG灌胃，检测机体血糖、胰岛素和胰高血糖素水平，探讨EGCG对胰岛素治疗糖尿病大鼠的影响。在体外实验中，不同浓度的EGCG对胰岛素含量检测没有影响，但高浓度的EGCG(2和/1 mg/mL)会使胰高血糖素的检测值偏高，其具体原因有待于进一步研究。因此，在灌胃糖尿病大鼠时，宜将EGCG浓度控制在1 mg/mL以下，以保证试验结果的准确性。

以往研究表明EGCG具有减缓胰岛素抵抗的作用，Potenza等在大鼠体内发现EGCG对胰岛素有增敏作用[15]。但是针对胰岛素缺乏的动物模型，EGCG有无作用未见文献报道。糖尿病人往往会出现胰岛素缺乏现象，也会常常采用胰岛素治疗。那么胰岛素治疗的糖尿病人是否能够正常饮茶而不影响治疗效果呢？这个问题有必要进行探讨，从而为糖尿病人提供科学依据。本研究通过EGCG灌胃的方式，模拟饮茶习惯，观察EGCG对胰岛素注射后的糖尿病大鼠的降血糖作用。研究发现，EGCG灌胃2 h内，糖尿病大鼠的血糖水平并没有降低，EGCG联合胰岛素组与胰岛素组相比血糖差异不显著，这与以往文献[16-17]中报道不符，这可能与药物干预时间过短或EGCG容易被氧化，生物利用度差的特点有关[18]。研究结果表明，联用组与胰岛素组之间，EGCG组与对照组之间胰岛素和胰高血糖素的含量没有显著性差异，此结果说明饮用富含EGCG的茶对糖尿病病人血液中胰岛素和胰高血糖素水平无影响，不会干扰胰岛素药效。

4 结 论

低浓度的EGCG处理(低于1 mg/mL)不会引起胰岛素和胰高血糖素检测的失真；EGCG对胰岛素治疗的糖尿病大鼠血液中血糖、胰岛素和胰高血糖素水平检测没有影响。总之，饮用富含EGCG的茶不会影响使用胰岛素治疗的糖尿病病人血液中的血糖、胰岛素和胰高血糖素水平，对胰岛素的治疗效果无影响。