2A肽介导的割手密ScNAC1、ScDREB融合基因表达载体构建

徐 荣，吴清莲，孟 玉，陈疏影,2，王先宏,2，何丽莲，李富生*

(1.云南农业大学农学与生物技术学院, 云南 昆明 650201；2.云南农业大学甘蔗研究所，云南 昆明 650201)

【研究意义】甘蔗(SaccharumofficinarumL.)是中国最主要的糖料作物之一，也是最具潜力的生物质能源作物之一[1]，富含铁、钙、磷及各种氨基酸，具有广阔的产品开发空间和市场竞争力。近年来，全球干旱化严重尤其云南蔗区常年干燥缺水，亟待选育出高糖、高产且抗旱的甘蔗品种以抵御极端气候[2]。但是，常规育种很难在短期内选育出满足生产需要的甘蔗新品种，将外源基因导入作物品种进行定向育种，可以在相对短的时间内获得高产、高抗的作物品种，转基因育种已经发展成为一种重要的、传统杂交育种方式的有效补充手段。【前人研究进展】植物的一些代谢途径或数量性状的遗传修饰是由多基因控制的，单个目的基因的转化已经不足以满足植物改良的需要，多基因转化研究应运而生，并迅速发展[3]。目前，多基因转化主要有杂交法、再转化法、共转化法、基因连接法及多顺反子转基因等。其中，由2A肽段介导的多顺反子转基因的多基因载体构建策略受到广泛关注，在这一策略中多个基因共用一个启动子和终止子表达，具有载体较小、高效表达、定点表达等优点，是目前较为理想的多基因表达策略[4]。【本研究切入点】以前期在割手密中克隆到的具有抗旱功能ScNAC1和ScDREB为目的基因，以对单子叶植物高效、专一的Ubiquitin为启动子，以适于单子叶植物遗传转化的表达载体pCAMBIA1300-nu为基础载体，通过改造后的FMDV2A多肽连接，采用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR，简称SOE PCR)将ScNAC1和ScDREB基因相融合，获得融合基因表达载体。【拟解决的关键问题】旨在探索甘蔗实现一次多基因遗传转化的可行性，并探讨多基因整合的相互作用问题。

1 材料与方法

1.1 材料

含有玉米Ubi启动子的pCAMBIA1300-nu植物表达载体、含有割手密ScNAC1的pFGC941-ScNAC1-GFP表达载体、含有ScDREB的pFGC941-ScDREB-GFP表达载体、大肠杆菌菌株DH5α、根癌农杆菌菌株EHA105，均由本课题组保存。

KOD DNA聚合酶购自Toyobo公司，限制性内切酶、胶回收试剂盒、质粒提取与纯化试剂盒均购自TaKaRa公司；重组试剂盒购自Vazyme公司；Ladder DNA marker购自Tiangen公司；卡那霉素(Km)、利福平(Rif)购自Solarbio公司；琼脂糖购自GENE公司；PCR引物合成及基因测序均由上海生工完成。

1.2 引物设计

1.2.1 线性化载体上下游引物设计 根据已知的ScNAC1和ScDREB基因序列，参照ClonExpress®II(诺唯赞，C112)说明书，在插入片段正反向扩增引物的5’端引入线性化载体两末端同源序列，即5’-上游载体末端同源序列 + 酶切位点 + 基因特异性正向扩增引物序列-3’、5’-下游载体末端同源序列 + 酶切位点 + 基因特异性反向扩增引物序列-3’，这样可以使扩增后的插入片段5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应一致的同源序列。依据以上原理，分别设计ScNAC1-2A-ScDREB融合片段PCR扩增的引物为表1中的1NF、1DR；ScDREB-2A-ScNAC1融合片段PCR扩增的引物见表1中的2DF、2FR，以便与线性化载体上/下游末端进行同源重组。

1.2.2 融合基因片段间引物设计 首先从NCBI数据库下载到来自口蹄疫病毒FMDV 2A的核苷酸序列，并根据参考文献在上游蛋白与2A间加入甘氨酸-色氨酸-甘氨酸(GSG)等构象灵活氨基酸序列，以提高2A肽段的剪切效率，促进基因表达[5-7]。利用这段改造过的2A多肽将ScNAC1和ScDREB基因按照不同前后顺序串联在一起。改造过的2A多肽有69个核苷酸：ggatccggcCAATTGCTTAACTTCGACTTATTGAAGCTTGCTGGTGACGTTGA

GTCTAACCCAGGTCCA，编码23个氨基酸：GSGQLLNFDLLKLAGDVESNPGP。表1中的1NR、1DF、2DR、2NF分别为2个载体的融合部分引物，其中黑色序列无下划线序列分别为ScNAC1基因的3’、5’端互补序列和ScDREB基因的3’、5’端互补序列，黑色单下划线序列为改造后的2A序列，黑色双下划线为融合基因反向互补序列，该互补序列可以满足SOE PCR扩增是将ScNAC1和ScDREB基因连接在一起的需要(图2)。引物交由上海生工合成。

1.3 融合片段的获得

1.3.1ScNAC1和ScDREB基因的独立扩增 按照常规PCR方法进行ScNAC1和ScDREB基因的独立扩增，扩增使用KOD DNA聚合酶、以pFGC941-ScNAC1-GFP质粒为模板，利用引物1NF与1NR扩增ScNAC1-2A片段(PCR产物1)；以pFGC941-ScDREB-GFP质粒为模板，利用引物1DF与1DR扩增2A-ScDREB片段(PCR产物2)；以pFGC941-ScNAC1-GFP质粒为模板，利用引物2DF与2DR扩增ScDREB-2A片段(PCR产物3)；以pFGC941-ScDREB-GFP质粒为模板，利用引物2NF与2NR扩增2A-ScNAC1片段(PCR产物4)；PCR扩增体系：1 μl模板DNA、2 μl 10×Buffer、2 μl dNTP Mixture (10 mM)、2 μl MgSO4(25mM)、0.6 μl Primer F (10 μM)(1NF/1DF/2DF/2NF)、0.6 μl Primer R (10 μM)(1NR/1DR/2DR/2NR)、0.5 μl KOD (1 U/μl)、ddH2O补齐20 μl体系。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min，98 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、68 ℃延伸2 min、32 个循环，68 ℃延伸5 min，25 ℃保温，4 ℃保存。将获得扩增产物分别用1.2 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测，确定目的条带后，切胶回收。

1.3.2 PCR扩增融合基因 分别测定各回收产物中目的片段的浓度，并稀释成同一浓度，取0.6 μl产物P1、0.4 μl产物P2预混后作为模板，采用引物1NF、1DR扩增融合基因ScNAC1-2A-ScDREB；取0.4 μl产物P3、0.6 μl产物P4预混后作为模板，采用引物1NF、1DR扩增融合基因ScDREB-2A-ScNAC1；采用重叠延伸技术SOE PCR一步法进行扩增，扩增体系如表2，扩增程序同单基因扩增。

表1 扩增引物

注：灰色序列为pCAM1300nu载体同源序列，黑色序列为目的基因部分序列，单下划线序列为2A部分序列，双下划线为融合基因反向互补序列，斜体序列为酶切位点。

Note: The gray sequence is the homologous sequence of pCAM1300nu vector; The black sequence is the partial sequence of the target gene; The single underlined sequence is the partial sequence of 2A; The double underlined sequence is the reverse complementary sequence of fusion gene; The italic sequence is the restriction site.

1.4 融合基因片段与p1300nu同源重组及转化

先用BamH I与SacI将pCAM1300-nu质粒线性化双酶切并回收，使用电泳比较条带亮度的方法对载体和插入的融合基因片段进行定量，参照诺唯赞C112-ClonExpress-II One Step Cloning Kit说明书，按照载体与插入片段摩尔比为1∶2的分别取线性化载体(100 ng/μl)2 μl、融合基因片段(20 ng/μl)4 μl；5×CE II Buffer 4 μl；Exnase II 2 μl；加ddH2O 8 μl至20 μl的重组反应体系，配制时在冰上操作。使用移液枪轻轻洗打混匀(不能震荡混匀)，并短暂离心，在PCR仪上37 ℃反应30 min后，降至4 ℃或立即置于冰上，-20 ℃冰箱可存放7 d备用。重组产物转化至DH5α 大肠杆菌，在Kan抗性的LB平板上进行筛选，PCR及酶切验证后选择阳性克隆送上海生工测序。

表2 融合基因扩增PCR体系

2 结果与分析

2.1 待融合片段的获得

以pFGC941-ScNAC1-GFP质粒为模板，采用1NF和1NR引物扩增得到的片段P1(ScNAC1-2A)，长度为1259 bp，包含去掉终止密码子的ScNAC1和2A序列5’端的50 bp；采用引物2NF和2NR扩增得到片段P4(2A-ScNAC1)，其中长度为1251 bp，包含2A序列3’端的39 bp和ScNAC1；凝胶电泳分析结果表明，扩增产物长度约为1200 bp，符合预期，而且条带清晰、没有杂带、特异性强(图1 a,b)。采用引物1DF和1DR扩增得到片段P2(2A-ScDREB)，长度为915 bp，包含2A序列3’端的39 bp和ScDREB，采用2DF和2DR引物扩增得到的片段P3(ScNAC1-2A)，长度为923 bp，包含去掉终止密码子的ScDREB和2A序列5’端的50 bp；凝胶电泳分析结果表明，扩增产物长度约为1200 bp，符合预期，而且条带清晰、没有杂带、特异性强(图1 c,d)。

a：片段P1 (ScNAC1-2A)；b：片段P2(2A-ScNAC1)；c：片段P3(2A-ScDREB)；d：片段P4(ScDREB-2A)a: Fragment P1 (ScNAC1-2A); b: Fragment P2 (2A-ScNAC1); c: Fragment P3 (2A-ScDREB); d: Fragment P4 (ScDREB-2A)图1 待融合片段PCR扩增产物Fig.1 PCR products to be fused

2.2 融合基因的获得

上述扩增得到的 P1和P2片段按比例混匀后，以此为模板，采用1NF和1DR引物扩增，得到融合基因ScNAC1-2A-ScDREB，长度为2154 bp；将P3和P4片段按比例混匀后，以此为模板，采用2DF和2FR引物扩增，得到融合基因ScDREB-2A-ScNAC1，同样长度也为2154 bp，凝胶成像结果表明，以上两段融合基因片段扩增产物长度均约为2200 bp，符合预期，而且条带清晰、没有杂带、特异性较强(图2)。图3为SOE PCR 重组融合基因ScNAC1-2A-ScDREB的策略示意图。

2.3 融合基因表达载体的获得

将被BamH I与SacI线性化双酶切的p1300nu质粒与上述步骤获得的融合基因ScNAC1-2A-ScDREB、ScDREB-2A-ScNAC1分别进行同源重组，获得的重组产物进行酶切验证(图4)，都切出了载体的大条带和连接片段的小条带，证明连接成功。于是，分别将重组产物命名为p1300:ScNAC1:2A:ScDREB、p1300:ScDREB:2A:ScNAC1。图5为载体构建示意图。

a：融合片段ScNAC1-2A-ScDREB；b：融合片段ScDREB-2A-ScNAC1a: Fusion fragment ScNAC1-2A-ScDREB; b: Fusion fragment ScDREB-2A-ScNAC1图2 融合基因的PCR扩增Fig.2 PCR amplification of fusion genes

图3 SOE PCR 重组融合基因 ScNAC1-2A-ScDREB的策略Fig.3 Construction of ScNAC1-2A-ScDREB by splicing by overlap extension(SOE)

a：质粒 p1300:ScNAC1:2A:ScDREB；b：质粒p1300:ScDREB:2A:ScNAC1。a: Plasmid p1300: ScNAC1:2A:ScDREB; b: Plasmid p1300: ScDREB:2A:ScNAC1.图4 重组产物的酶切鉴定Fig.4 Enzyme digestion analysis of recombinant products

图5 融合基因表达载体构建Fig.5 Construction of fusion genes expression vector

2.4 融合基因测序

酶切验证后的重组质粒转化重DH5α大肠杆菌，选择阳性克隆送上海生工测序，测序结果验证了扩增产物额正确性，融合基因ScNAC1-2A-ScDREB、ScDREB-2A-ScNAC1在扩增过程中皆无突变发生。

3 讨 论

现有的多基因表达载体构建策略最主要的不足之处在于载体容纳能力有限，同一载体上的多基因表达不均衡，其蛋白活性及表达效率不及单基因表达载体[8]。自剪切2A 肽的融合基因策略不需要内切酶消化和连接酶处理，利用引物互补方法可简单迅速的将2个甚至2个以上DNA片段连在一起，规避了多基因表达时蛋白活性不高或下游基因表达量低等缺点[9]。Yeo等[10]利用2A 肽连接海藻糖-6-磷酸合成酶1 与海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因，构建融合基因表达载体进行遗传转化，发现其具有刺激马铃薯合成海藻糖而增强其抗旱能力。Ralley等[11]将从海洋细菌中获取的胡萝卜素4,4'-氧合酶和3,3'-羟化酶基因，通过2A 肽进行连接，遗传转化到不能合成酮类胡萝卜素的高等植物(如西红柿和烟草等)中，赋予了西红柿和烟草生产虾青素以及斑蝥素的能力。本研究运用2A 肽将具有抗旱功能的ScNAC1和ScDREB基因连接起来，实现2个基因的共表达。为避免上游蛋白信号肽影响 2A 肽的剪切效率，导致下游蛋白出现在内质网上[12]，可在2A 肽的上游添加一段氨基酸残基，如 GSG 或 SGSG，以增加2A 肽的剪切效率，促进下游蛋白正确定位，同时也可改变 2A肽上下游基因的顺序[13]。基于此，在上游基因与2A序列之间添加了一段氨基酸残基 Gly-Ser-Gly，并分别设置了ScNAC1-2A-ScDREB和ScDREB-2A-ScNAC1两种组合，以探讨不同位置组合基因表达的差异，探索2个基因的位置效应。

重叠PCR(gene splicing by overlap extension PCR，简称SOE PCR)技术包括一步法和二步法[8]，具有不需要酶切位点，不需要在基因序列中引入的碱基序列的优点。张丽丽等[14]以多毛番茄抗冷转录因子LhCBF1基因、EGFP基因及RD29A启动子进行SOE PCR，二步法步骤相对繁琐，但在第一步时，融合基因模板得到大量扩增可得到更高浓度的产物，但也存在非特异性扩增；而一步法，由于模板延伸和基因扩增同时进行，产物浓度相对较低，但具有较高特异性。本研究采用一步法，获得具有较高特异性的扩增产物，能够满足直接与载体同源重组的需要，并以大小片段1.5︰1的比例先进行混合，从而增加2个基因融合的成功率。应用SOE PCR进行片段连接的关键是引物设计，嵌合引物要求具有相近的退火温度，序列长度在50～70 bp，而且重叠部分的序列要达到一定的长度，会增加融合的成功几率[15]。本研究设计的4条嵌合引物中1NR、2DR长度为69 bp，1DF、2NF长度为57 bp，重叠部分长度为20 bp，互补序列可以满足将2个基因融合在一起的需要。

通过转基因技术改良作物品质近些年已成为热点研究问题，随着基因工程技术的不断发展，单基因转化技术已不能满足人们对作物改良的需要。更多的研究者将研究方向转向研究参与某个代谢途径的多个基因在植物体中共同表达，通过对多基因调控来获取更好的作物目的性状。新兴的以2A肽连接的基因融合方法，具有操作简便、成本低、自剪切高效的优点，适用于探讨多基因在某一代谢功能中相互作用的规律[16]。本研究利用前期克隆的ScNAC1和ScDREB抗旱基因构建多基因表达整体，后期将通过农杆菌侵染法转化甘蔗愈伤，并结合单个基因的表达情况进行分析，以探讨上述2个基因在甘蔗再生植株中的表达规律及互作效应。

4 结 论

本研究通过设计特异引物利用SOE PCR方法将ScNAC1、SCDREB基因进行融合，并通过同源重组的方法连接植物表达载体，经PCR、酶切及测序验证，成功构建了p1300:ScNAC1:2A:ScDREB、p1300:ScDREB:2A:ScNAC1融合基因表达载体。