藏山羊AQP7基因克隆和不同组织器官差异表达分析

张亚楠，王 永,，朱江江，许 晴，林亚秋*

(1. 西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部、四川省重点实验室，四川 成都 610041)

【前人研究进展】水通道蛋白7(aquaporin 7，AQP7)是1997年Ishibashi K等[1]在大鼠睾丸中发现的具有促进甘油穿过细胞膜转运能力的成孔跨膜蛋白，属于水通道蛋白(AQPs)家族中的重要成员。目前为止，研究发现水通道蛋白家族成员共有13个，即AQP0-APQ12，按功能可分为只转运水分子的AQPs、既可转运水分子又可转运甘油的水甘油通道和其功能尚未阐明的超AQPs三个亚家族[2]，而AQP7是一类水甘油通道蛋白。研究发现，AQP7能控制脂肪细胞中脂肪源甘油的转运，其缺乏可降低质膜甘油通透性，减少血浆甘油，同时可提高脂肪细胞甘油激酶活性和促进甘油三酯的合成，进而导致脂肪细胞内甘油和甘油三酯的蓄积，从而增加脂肪细胞体积和脂肪组织质量[3-7]。同时体内外试验发现AQP7在体内控制胰岛β细胞数量和胰岛素分泌方面起着关键作用[8]。胰岛素刺激体外人网膜脂肪组织可增加AQP7蛋白表达，但是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂可抑制这种现象[9]。与之相反，异丙肾上腺素是一种选择性的β-激动剂，它能刺激脂肪分解，降低AQP7的丰度[10]。【研究意义】藏山羊是我国具有4000多年饲养历史的特有珍稀畜种，其主要分布在海拔1500～5000 m的青藏高原、四川西部、甘肃等地，是藏区人民重要的生活和生产资料，同时藏山羊耐粗饲, 抗逆性强, 肌肉细嫩，风味好[11]。因而提高藏山羊甘油转运能力有助于增加其脂肪含量从而提高其肉质，而目前对AQP7的研究主要集中于人、大鼠、牛和猪等哺乳动物中，尚未见在山羊中的相关报道。【本研究切入点】因此本试验拟通过RT-PCR方法克隆藏山羊AQP7基因序列，并对序列进行生物学信息分析，同时利用实时荧光定量PCR技术(quantitative Real-time PCR，qPCR)阐明其在藏山羊各组织中的表达模式。【拟解决的关键问题】为进一步研究该基因在藏山羊脂代谢中的作用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用试验动物为来自四川省若尔盖种羊场的2.5岁健康雄性藏山羊(n=3)，现场屠宰后活体采集各个样本(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪、背最长肌、股二头肌和臂三头肌)，迅速置于液氮中保存带回实验室备用。

1.2 试剂

Trizol试剂盒、pMD-19T载体与荧光定量试剂盒SYBRPremix ExTaq(2×)均购自大连TaKaRa公司, 2×LongTaqPCR Master Mix、感受态细胞DH5α和DNA纯化回收试剂盒(Universal DNA Purification Kit)均购自天根生化科技有限公司(北京)，反转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)购自Thermo公司(美国)。

1.3 方法

1.3.1 藏山羊AQP7基因克隆 采用Trizol法提取藏山羊脂肪组织的总RNA，并合成cDNA。根据GenBank上登陆的牛AQP7基因序列(NM_001076378)，利用PrimerPremier 5.0软件设计基因克隆引物(表1)。25 μl PCR扩增体系： 2×GC-Rich PCR MasterMix 12.5 μl，10 μmol/L上、下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 9.5 μl。扩增条件：预变性(94 ℃，3 min)，变性(94 ℃，30 s)，退火(60 ℃，1 min 10 s)，延伸(72 ℃，1 min)，35个循环，延伸(72 ℃，10 min)。2 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。按照胶回收试剂盒说明书回收纯化目的片段，然后将纯化的目的片段与pMD-19T载体16 ℃连接2 h，并转化至DH5α细胞中，氨苄抗性平板挑选阳性菌落并进行菌液PCR鉴定，最后送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.3.2 藏山羊AQP7基因生物信息学分析 蛋白理化性质采用ExPASy ProtParam分析；DNAMAN进行序列比对；磷酸化位点、O糖基化位点、N糖基化位点预测使用NetPhos3.1、NetOGlyc1.0和NetNGlyc 3.1分析；信号肽应用SignaIP 4.1 Server进行分析，跨膜结构域利用TMHMM预测，亚细胞定位采用PSORTII进行分析；结构域预测利用NCBI的Conserved Domain程序进行；蛋白质二级结构和三级结构预测分别运用PRABI、Swiss-model进行；同源性分析采用NCBI中Blast进行，进化树使用clustalx 1.83和MEGA5.0构建。

1.3.3 藏山羊AQP7基因组织表达分析 提取藏山羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪、背最长肌、股二头肌和臂三头肌等组织的总RNA，并合成cDNA，根据克隆测序获得的AQP7基因序列和3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因设计特异引物，并利用qPCR技术检测AQP7在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪、背最长肌、股二头肌和臂三头肌中的相对表达情况。20 μl反应体系: SYBR®Premix ExTaqTM(2×)10 μl，cDNA 1 μl，10 μmol/L上、下游引物各1 μl，RNase Freed H2O 7 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，39个循环，每个待测样本设2个重复。用2-ΔΔCt法计算荧光定量结果。

2 结果与分析

2.1 藏山羊AQP7 基因克隆

以藏山羊脂肪组织cDNA为模板，通过PCR扩增及2 %琼脂糖凝胶电泳检测获得预期相符的目的片段条带，送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序后获得AQP7基因序列全长1119 bp，包含CDS区序列993 bp，5’ UTR序列54 bp和3’ UTR序列72 bp，终止密码子为TAA，编码330个氨基酸。

表1 引物信息

注：S：正义链引物；A：反义链引物；GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶。

Note：S: Sense primer; A: Antisense primer; GAPDH: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.

2.2 藏山羊AQP7基因理化性质分析

利用ExPASy ProtParam分析藏山羊AQP7蛋白质理化性质，结果显示，藏山羊AQ7蛋白总原子数为5082，其分子式为C1648H2548N422O447S17，分子量为35.969 kDa，理论等电点为9.2，说明该蛋白呈碱性。带正电的残基总数(Arg + Lys)为24，带负电的残基总数(Asp + Glu)为18，其不稳定系数为35.77，亲水性平均值为0.335，说明该蛋白为稳定疏水蛋白。

2.3 藏山羊AQP7基因序列分析

通过DNAMAN比对藏山羊和山羊预测序列(XM_005684061.3)AQP7基因核苷酸与氨基酸序列同源性发现，藏山羊与山羊核苷酸同源性分别为99 %，其氨基酸同源性为100 %。检测到碱基由A突变为G，导致密码子由TCA变为TCG，而比对氨基酸序列发现其编码的氨基酸没有突变。

通过NetPhos3.1、NetOGlyc1.0和NetNGlyc 3.1预测其磷酸化位点、O糖基化位点和N糖基化位点，结果显示藏山羊AQP7蛋白共有31个潜在磷酸化位点，其中丝氨酸(Ser)位点16个，苏氨酸(Thr)位点13个，酪氨酸(Tyr)位点2个，8个潜在O糖基化位点和4个潜在N糖基化位点。SignaIP 4.1 Server预测结果显示其无信号肽序列，TMHMM结果显示其含有6个跨膜结构域，PSORT II亚细胞定位显示其主要在质膜(47.8 %)、内质网(21.7 %)和液泡(17.4 %)中发挥作用，STRING分析其蛋白质互作，显示其与AQP6、AQP8、STK4、AQP11、GK、GK2、GK5等存在相互作用(图1)，同时结构域预测显示其含有一个主要内在蛋白(MIP)结构域。

通过PRABI软件预测二级结构显示，其主要有α-螺旋，延伸链和无规则卷曲3种结构，其有62个氨基酸可能形成阿尔法螺旋，93个氨基酸可能形成延伸链和175个氨基酸可能形成无规则卷曲。

图1 藏山羊AQP7蛋白互作Fig.1 Tibetan goat AQP7 protein interaction

2.4 藏山羊AQP7基因氨基酸同源性分析及构建进化树

通过NCBI在线比对氨基酸同源性发现藏山羊和山羊(XP_005684118)、绵羊(XP_004004192.1)、牛(NP_001069846.1)、虎皮鹦鹉(XP_005143221.1)、猪(NP_001106909.1)、人(NP_001161.1)、野鸭(XP_021131239.1)、羊驼(XP_006216905.1)、猕猴(XP_001100020.1)、家犬(XP_013973284.1)、猫(XP_006939273.1)、斑马鱼(NP_956204.2)、绿海龟(XP_007063361.1)、家鼠(NP_031499.1)，其同源性分别为100 %、99 %、93 %、54 %、77 %、72 %、52 %、78 %、71 %、75 %、76 %、51 %、55 %、71 %。其进化树结果表明藏山羊与山羊亲缘性最近(图2)。

图2 NJ法构建藏山羊AQP7氨基酸系统进化树Fig.2 Construction of phylogenetic tree of AQP7 amino acid system of Tibetan goats by NJ method

n=3；不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P>0.05)n=3;Different superscript lowercase and capital letters respectively showed significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), no obvious difference is indicated by the same letter(P>0.05)图3 AQP7 mRNA在藏山羊不同组织中的相对表达水平Fig.3 Relative expression levels of AQP7 mRNA in different tissues of Tibetan goats

2.5 藏山羊AQP7基因组织表达分析

组织表达结果显示(图3)，AQP7基因在藏山羊各组织中均有表达，其在脂肪和肾脏组织中的表达量最高，均极显著高于其他组织(P<0.01)，其次在心脏组织中表达量最高，极显著高于其他组织(P<0.01)。

3 讨 论

近年来，深入研究肌内脂肪调控机制发现提高肌内脂肪含量有助于提高肉的嫩度及多汁性，因此如何提高肌内脂肪含量成为研究人员所关注的热点。而阐明肌内脂肪沉积的分子机制对动物肉品质的改善具有重要的理论与实际意义。前人研究表明AQP7基因与脂代谢相关，因此引起了本实验室的兴趣，而获得基因序列和阐明其组织表达是研究其功能的基础，因此本研究拟克隆获得藏山羊AQP7基因序列和阐明其组织表达谱，进一步揭示AQP7基因在藏山羊脂质代谢中的作用提供理论基础。

本研究获得AQP7基因序列全长1119 bp，包含CDS区序列993 bp，编码330个氨基酸，AQP7含有一个主要内在蛋白(MIP)结构域。序列分析显示，藏山羊AQP7蛋白共有31个潜在磷酸化位点，其中潜在丝氨酸(Ser)位点16个，潜在苏氨酸(Thr)位点13个，潜在酪氨酸(Tyr)位点2个，8个潜在O糖基化位点和4个潜在N糖基化位点，这可能与蛋白质翻译后修饰有关[12]。本研究还发现AQP7蛋白主要存在于质膜中，刘庆双等[13]对大鼠睾丸AQP7 mRNA与蛋白质的定位也发现这个现象，而Kuriyama H等[14]发现人类AQP7具有6个跨膜结构域，同时本研究也发现AQP7蛋白含有6个跨膜结构域，说明AQP7主要在质膜中发挥作用，因而其无信号肽序列。通过比较藏山羊与山羊CDS序列，存在一个同义突变。同时与绵羊和牛CDS序列相比，分别存在3个和22个错义突变。氨基酸的改变导致其二级结构发生变化，其三级结构也证实其二级结构在其之间存在差异，表明AQP7蛋白在不同物种间可能存在差异，而氨基酸改变导致其蛋白质结构的改变是否会引起其功能的变化以及在不同物种间的功能是否有变化仍需进一步证明。

组织表达模式发现，AQP7在藏山羊各组织中均呈不同程度的表达，其中在脂肪组织和肾脏中表达水平最高，这可能与AQP7在脂肪组织中促进甘油跨细胞膜转运以及在肾脏中对甘油的重吸收有关[15-16]。Kishida等[17]研究发现AQP7在小鼠骨骼肌中少量表达，这与本研究结果相似。王宏丽等[18]发现高脂肪饮食小鼠脂肪组织AQP7表达下调，而且其体重及主要脂肪组织增重明显。Hibuse T等[19]研究发现AQP7缺乏小鼠心肌甘油消耗和ATP含量显著降低，提示AQP 7在心肌甘油代谢和ATP生成中具有调控作用。同时进一步研究发现肥胖瘦素缺乏ob/ob小鼠骨骼肌AQP7表达与WT小鼠相比显著增加[3]，表明AQP7可通过多种分子机制调控脂质代谢。根据本实验结果即AQP7在藏山羊脂肪组织中的高水平表达，结合上述在小鼠等模式生物中的研究，推测AQP7可能在藏山羊的脂代谢、脂肪沉积中发挥重要调控作用，但具体的调控作用及可能的机制则需进一步研究来阐明。

4 结 论

本研究成功克隆包含完整CDS区序列的藏山羊AQP7基因序列1119 bp，具有跨膜结构，无信号肽，主要在质膜中发挥作用；组织表达谱表明AQP7基因广泛表达于藏山羊各组织中，其在脂肪组织和肾脏组织中表达水平最高。本试验结果为研究AQP7基因在藏山羊脂代谢中的作用提供重要的基础数据。