梨园土壤真菌群落垂直分布及功能预测分析

冀明辉　高丽娟　李龙飞　徐金涛　郝宝锋

关键词：梨园：真菌：土壤：垂直分布：差异物种：功能预测

中图分类号：S661.2：Q938.1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023） 03-0083-12

土壤、微生物、植物間相互联系紧密，土壤是植物吸收营养的重要场所，直接影响植物的生长发育，对微生物群落结构及多样性影响显著。通过对不同深度土壤微生物的研究，能更确切地了解微生物在土壤中的变化。土壤硝态氮、有机碳能显著影响土壤真菌群落结构。不同类型土壤微生物群落组成各不相同，作用方式复杂多样。陈娟等研究发现潮土相对于稻田土和黄棕土抗病性更强。微生物为生态系统中重要的一环，通常真菌与细菌通过相互作用来调节土壤生态系统。大多数真菌生活在土壤或植物残体中，可增强土壤微生物酶活性。Li等发现通过接种外生菌根能提高土壤基质可用性，减轻酸雨对土壤中氮循环微生物的影响。但真菌对植物也有不利影响，土壤连作可增加真菌数量，降低土壤质量，抑制植物生长。研究发现Cortinarius acutu s.l.会导致表土中局部碳储存降低33%。子囊菌门（Asco-mycota）会导致植物枯萎，担子菌门（Basidiomyco-ta）会引起小麦锈病、玉米黑穗病等多种病害，壶菌门（Chytridiomycota）会诱发植物猝倒病、癌肿病，镰刀菌属（Fusarium，）通常作为植物病原菌存在。细菌或真菌病害往往伴随着土壤微生物群落的变化。黄伟雄等研究发现，荔枝在感染根腐病后，土壤中真菌群落多样性下降，种类减少，均匀度上升。感染根结线虫的土壤和健康土壤在真菌门类上有明显差异。韩凤等发现根腐病改变了多花黄精根际土壤的真菌组成。目前在改善微生物群落多样性方面的研究较多。刘业萍、程分生等研究表明，生草能显著提高土壤理化性质，改善土壤微生物群落结构，提高土壤中有机碳含量。通过轮作可降低真菌丰度，改善真菌群落组成，调节微生物功能。除此之外，一些学者通过土壤消毒或生物菌剂可达到平衡微生物的目的。赵晓东、陈利达等采用熏蒸处理可抑制土壤镰孢病菌，改善土壤结构，调节真菌群落。刘亮亮等通过土壤强还原消毒增加了有益真菌的相对丰度，降低西瓜枯萎病的发病率。王辉等利用黄柄曲霉可提高土壤营养状况，降低辣椒疫病带来的影响。木霉菌剂能使茉莉根际土壤微生物明显变化，提高其生长速率。氯吡嗪与多唑醇交替使用，能有效改善土壤理化性质、微生物群落，提高草莓产量。随后，绿色、可持续的研究理念逐渐增强。屈忠义、姚彤等利用生物炭来调节土壤理化性质，可改变真菌丰度，增加土壤肥力。刘莉等指出，枝条粉碎还田能提高土壤有机质含量，增加微生物数量。有学者利用水稻和鱼类共生系统来减少化肥农药的施用，可提高土壤质量，调节优势真菌丰度。

目前，土壤真菌群落研究主要集中在通过轮作、生草、消毒、共生等方式改善真菌群落结构，提高土壤质量，而忽略了土壤垂直分布微生物群落差异。基于此，本试验以梨园土壤为研究对象，通过对不同深度土壤进行理化性状测定及ITS测序分析，对真菌群落在土壤中的垂直分布情况及功能进行预测分析，以期为梨园土壤微生物群落的改善等提供理论参考。

1材料与方法

1.1样品采集

2021年4月，于河北省农林科学院昌黎果树研究所孔庄示范基地梨园（2009至今，土壤管理模式为清耕）进行土壤样品采集。由于距梨树主干Im左右，根系主要分布在距地面10～30 cm的土层内，所以本试验选取距主干1m左右、深度为5～35 cm土壤，采用“S”形取样法，分别取5～15cm（A处理）、15～25 cm（B处理）、25～35cm（C处理）三种不同深度土壤各5份，共计15份，将采集到的不同深度土样分别混匀，采用四分法留样。样品分为两份，一份用于土壤理化性质测定，另一份用于真菌ITS1-5F区测序分析。

1.2土壤理化性质测定

土壤有机质含量的测定采用重铬酸钾容量法（外加热法）。土壤碱解氮含量的测定采用碱解扩散法，土壤速效磷含量的测定采用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法，土壤速效钾含量的测定采用乙酸铵提取-原子发射光度法。

1.3土壤DNA的提取与分析

采用CTAB法对土壤样品进行DNA提取。采用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix试剂盒（New England Biolabs）进行PCR扩增，引物序列为：ITS5-1737F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAA-CAAGG-3′），ITS2-2043R（5′-GCTGCGTTCT-TCATCGATGC-3′）。PCR扩增程序：98C预变性1min;98℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，720C延伸5 min。随后进行文库构建、上机测序、下机数据拆分，整理得到有效数据。最后以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，同时筛选OTUs的代表序列并进行物种注释分析。利用诺禾云平台（https：//magic. novogene.com/custom-er/main#/login）基于有效数据进行OTUs聚类和物种注释、α多样性分析、Venn图绘制等。

1.4数据分析

所有数据经Microsoft Excel 2019进行处理，采用SPSS 20.0进行单因素方差分析。土壤理化性质与真菌群落的相关性采用Pearson相关系数法进行分析。

2结果与分析

2.1土壤理化性质

由表1可知，有机质（SOM）、碱解氮（AN）、速效磷（AP）、速效钾（AK）均随土壤深度的增加而降低，且降低速率逐渐减缓。其中SOM、AP、AK在处理A、B、C中均呈显著性差异。A处理SOM含量为B处理的1.46倍、C处理的1.85倍；A处理AN含量为B处理的1.65倍、C处理的2.00倍；A处理AP含量为B处理的1.98倍、C处理的5.09倍：A处理AK含量为B处理的1.91倍、C处理的3.57倍。所以，四种土壤养分随土壤深度的变化速率为SOM

2.2土壤样品测序深度分析

为保证测序数据的准确性，对土壤样品测序数据进行分析。如图1所示，曲线逐渐趋于平缓，说明测序数据合理。A处理共获得Raw Tags91172条，拼接和质控后，得到Clean Tags 90 983條，嵌合体过滤后，得到Effective Tags 65 252条；B处理共获得Raw Tags 93 131条，拼接和质控后，得到Clean Tags 88 402条，嵌合体过滤后，得到Effective Tags 65 029条；C处理共获得Raw Tags 95 239条，进行拼接和质控，得到Clean Tags 94 674条，嵌合体过滤后，得到Effective Tags63 748条。

2.3不同土壤深度真菌群落多样性分析

由图2可知，A处理共有OTUs 1360个，B处理共有OTUs 1 320个，C处理共有OUTs 1 239个。A、B处理相同OTUs为842个，分别占A、B处理的61.91%、63.79%；B、C处理相同OTUs为701个，分别占B、C处理的53.11%、56.58%;A、C处理相同OTUs为739个，分别占A、C处理的54.34%、59.64%。A、B、C处理相同OTUs为571个，分别占A、B、C处理的41.99%、43.26%、46.09%。A、B、C处理各自特有的OTUs为350、348、370个，分别占A、B、C处理的25.74%、26.36%、29.8%。

如表2所示：随着土壤深度的增加，香农指数和辛普森指数均逐渐降低，说明物种多样性逐渐降低，但各处理均无显著差异。Chao 1指数和ACE指数也随土壤深度的加深逐渐降低，说明物种的丰度逐渐减少。

2.4不同土壤深度对真菌群落结构的影响

采用weighted_unifrac算法对土壤样品进行PCoA分析，横、纵坐标表示两个主成分，百分比表示其贡献值；样本距离越接近，物种组成结构越相似。由图3可知：第一主成分各处理间A与C的距离最远，B与C之间的距离最近；第二主成分各处理间A、B间距离较小。说明第一主成分A、C处理群落结构差异性大于A、B处理与B、C处理，第二主成分上A处理与B处理几乎无差异，均与C处理有较小差异。综合第一、第二主成分分析发现：随着土壤深度加大，土壤真菌结构逐渐差异化，A、C处理间的群落差异大于A、B处理和B、C处理。

通过MRPP检验可知：A与B处理、A与C处理、B与C处理组间差异均大于组内差异。为了解组间差异是否显著，绘制图4所示箱形图。箱子的中位数A>B>C，说明A处理物种多样性大于B、C处理。箱子的上下边缘代表95%置信区间，A箱子最扁，其次是B、C，说明A处理均一性好于B、C处理。通过Tukey检验可知：A与B、A与C、B与C处理的P值分别为0.433、0.038（P<0.05）、0.202，说明A、C处理间群落多样性差异显著，A与B、B与C处理间无显著性差异。

2.5不同土壤深度优势种群分析

为进一步了解不同土层间物种差异，对真菌种类进行分析。通过OUT注释分析得，A、B、C处理共有门类16个，纲类57个，目类135个，科类282个，属类470个，种类677个。取相对丰度前10的门类和属类进行分析。如图5a所示：土壤真菌门水平以子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、担子菌门（Basidiomycota）为主。其中子囊菌门在A、B、C处理中的占比分别为51.98%、51.57%、61.81%，为丰度最高的门类；被孢霉门在A、B、C处理中的占比分别为10.96%、16.02%、10.33%；担子菌门在A、B、C处理中的占比分别为12.63%、13.63%、7.14%。子囊菌门在C处理中含量最多，担子菌门、被孢霉门在B处理中含量最多，这说明真菌主要门类大部分分布在15～35 cm的土层中。如图5b所示：属水平上，主要由镰刀菌属（Fusarium，）、被孢菌属（Mortierella）、产油菌属（Solicoccozyma）组成。其中镰刀菌属在A、B、C处理中的占比分别为11.01%、18.51%、28.75%；被孢菌属在A、B、C处理中的占比分别为4.39%、13.81%、9.94%；产油菌属在A、B、C处理中的占比分别为9. 58%、4.72%、2.98%。

2.6不同土壤深度差异物种分析

通过对门水平处理间进行t-test差异物种分析，发现B、C处理间无差异物种。A处理罗兹菌门（Rozellomycota）相对丰度极显著大于B处理（图6a）；A处理担子菌门（Basidiomycota）相对丰度显著大于C处理，罗兹菌门相对丰度极显著大于C处理，子囊菌门（ Ascomycota）相对丰度显著小于C处理（图6b）。其中罗兹菌门在A与B、A与C处理间的相对丰度均呈显著性差异，说明其对土壤的敏感性较高。

属水平上，A、B处理差异物种共有13种，其中以产油菌属（Solicoccozyma）为主，A处理极显著高于B处理（图7a）。A、C处理差异物种共有18种，主要为镰刀菌属（Fusarium）、产油菌属。A处理产油菌属极显著高于C处理：C处理镰刀菌属（Fusarium）极显著高于A处理（图7b）。B、C处理差异物种共有8种，以瓶毛壳属（LophDtrichus）、姆拉克酵母菌属（Mrakia）为主。B处理瓶毛壳属、姆拉克酵母菌属显著高于C处理（图7c）。综上，差异物种数量随着土壤深度增加逐渐减少。

2.7功能多样性预测分析

为探究不同土壤深度真菌功能是否存在差异，选取土壤中真菌生态功能前10类进行统计。由图8可知：随着土壤深度的逐渐增加，未分配（Un-assigned）的类别逐渐减少。属于腐生营养的真菌分别占A、B、C处理的23.89%、34.39%、26.48%，分别为未界定腐生菌（Undefined_Saprotroph，A：21.66%、B：28.14%、C：24.27%）、外生菌根（Ectomycorrhizal，A：0.42%、B：4.99%、C：1.14%）、未界定腐生菌-木质腐生菌（Undefined_Saprotroph-Wood—Saprotroph，A：1.80%、B：1.26%、C：1.07%），此三种生态功能为真菌中主要的功能；其次为病原-腐生营养型，分别占A、B、C处理的11.87%、21.41%、31.99%，具体功能为植物病原菌-土壤腐生菌-木质腐生菌（Plant_Pathogen-Soil_Saprotroph-Wood _Saprotroph，A：11.01%、B：18.51%、C：28.75%）、动物病原菌-土壤腐生菌（Animal_Pathogen-Soil_ Saprotroph，A：0.73%、B：2.77%、C：1.86%）、动物病原菌-内生菌-真菌寄生菌-植物病原菌-木质腐生菌（Animal_Pathogen-Endophyte-Fungal_P arasite-Plant_Pathogen-Wood_Saprotroph，A：0.13%、B：0.12%、C：1.38%）；病原营养型分别占A、B、C处理的8.29%、2.26%、6.25%，具体功能为植物病原菌（Plant_Pathogen，A：7.00%、B：2.23%、C：6.24%）、动物寄生菌-真菌寄生菌（Animal_Parasite-Fungal_Parasite，A：1.29%、B：0.03%、C：0.01%）；丰度最少的为共生-腐生营养型的动物共生菌-未界定腐生菌（Animal_Endosymbiont-Undefined_Saprotroph），分别占A、B、C处理的0.05%、0.07%、1.43%。

由图9可以看出，A、B处理显著差异功能为动物病原菌-土壤腐生菌（Animal_Pathogen-Soil_Saprotroph），且B处理显著大于A处理；A处理在未分配（Unassigned）类型上极显著大于C处理，在植物病原菌-土壤腐生菌-木质腐生菌（Plant_Pathogen-Soil_Saprotroph-Wood_Saprotroph）上极显著小于C处理，在粪腐生菌-未界定腐生菌-木质腐生菌（Dung_Saprotroph-Undefined_Saprotroph-Wood_Saprotroph）、外生菌根（Ectomycorrhizal）上显著小于C处理。B处理中的动物病原菌（Ani-mal_Pathogen）显著大于C处理，叶片腐生菌（Leaf_Saprotroph）极显著小于C处理。

2.8土壤理化性质与真菌门类及其功能的相关性

为了解土壤理化性质与真菌间的关系，对其进行相关性分析。真菌丰度前10的门中，担子菌门（Basidiomycota）、油壶菌门（Olpidiomycota）与土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量呈正相关关系；芽枝霉门（Blastocladiomycota）与土壤有机质、碱解氮、速效磷含量呈正相关关系，与速效钾含量呈显著正相关关系；罗兹菌门（Rozellomy-cota）与土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量呈极显著正相关关系。子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、壶菌门（Chytridio-mycota）、蛙粪菌门（Basidiobolomycota）、隐孢子菌门（Aphelidiomycota）、捕虫霉门（Zoopagomycota）与土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量呈负相关关系（表3）。

如表4所示：未分配功能（F1）与罗兹菌门（Rozellomycota）呈极显著正相关关系。未界定腐生菌（F2）与子囊菌门（Ascomycota）显著负相关，与被孢霉门（Mortierellomycota）极显著正相关。外生菌根（F3）与担子菌门（Basidiomycota）、蛙粪菌门（Basidiobolomycota）、捕虫霉门（Zoopagomy-cota）显著正相关。植物病原菌-土壤腐生菌-木质腐生菌（F5）与罗兹菌门极显著负相关。动物病原菌-内生菌真菌-寄生菌-植物病原菌-木质腐生菌（F7）与隐孢子菌门（Aphelidiomycota）显著正相关。动物寄生菌-真菌寄生菌（F9）与油壶菌门（Olpidiomycota）极显著正相关。动物共生菌-未界定腐生菌（F10）与壶菌门（Chytridiomycota）极显著正相关。

3讨论

3.1不同土壤深度下真菌群落多样性

随土壤深度逐渐加深，有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量降低，且速率由高到低依次为速效磷、速效钾、碱解氮、有机质，说明速效磷含量对土壤深度反应敏感。25～35 cm土壤主要养分下降了1.85～5.09倍，推测梨园养分主要集中在5～25cm土层中。与土壤理化性质趋势相同，随土壤深度加深，OTUs、真菌多样性指数逐渐降低，但不同土层相同OTUs占40%以上，说明在5～35cm土层中真菌群落同质性较大；真菌多样性指数降低速度放缓，说明土壤深度越大，真菌微生物群落多样性及丰富度变化趋势减小，这与Xue等的研究结果相同。A与C处理间群落差异大于A与B、B与C处理，且经过Tukey检验A与C处理间群落差异具有显著性，同时A处理的多样性及均一度均大于B、C处理。由此可以猜测：群落丰富度越高，群落越稳定，真菌均一性越强；随土壤深度加大，群落丰富度及多样性减小，物种差异增加，群落多样性降低且速率减缓，不稳定性增加。通过相关性分析发现：土壤真菌多样性与有机质、碱解氮、速效磷、速效钾等土壤理化性质关系密切，这与靳海洋、Mayer等的研究结果一致。

3.2不同土壤深度与真菌物种关系

通过对不同土壤深度真菌进行OTUs注释分析，发现5～15 cm的物种最丰富。土壤真菌门类以子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierello-mycota）、担子菌门（Basidiomycota）为主，这与满百膺、罗正明等的研究结果一致。其中子囊菌门在25～35cm相对丰度最大且在5～35 cm土层中均达到50%，被孢霉门、担子菌门在15～25 cm土层相对丰度最大，其他类型（物种相对丰度排名10以外的物种）5～15 cm丰度最高，这也从侧面说明5～15 cm的物种多样性较高。属类以镰刀菌属（Fusarium，）、被孢菌属（Mortierella）、产油菌属（Solicoccozyma）为主，分别属于子囊菌门、被孢霉门和担子菌门，随着土壤深度增加，镰刀菌属逐渐增多，产油菌属逐渐降低，被孢菌属为15～25 cm最多。排名前10的属中子囊菌门包含5种，被孢霉门、担子菌门各2种，罗兹菌门（Roz-ellomycota）1种，说明子囊菌门不仅相对丰度大且物种多样性高。

在门水平上，A与B处理差异门类为1种，A与C处理为3种，B与C间无差异菌门；在属水平上，A与B处理差异物种有13种，A与C处理为18种，B与C处理有8种。A、B、C处理无共同的差异物种，说明随着土壤深度加大，真菌多样性差异明显。

在门类与土壤理化性质相关分析中，相对丰度前10的物种，有6类与土壤理化性质呈负相关，4类呈正相关。其中相对丰度大于50%的子囊菌门与土壤理化性质呈负相关，而土壤理化性质越高说明土壤越肥沃，越有利于植物生长，所以推测子囊菌门可能对植物的危害性大于益处。且随着土壤深度增加，子囊菌门相对丰度增加，由此可推测：土壤越深，对植物生长越不利，果树深层根系生长会受到抑制，这可能是梨树根系主要分布在树冠内浅层土中的原因。罗兹菌门与有机质、碱解氮、速效磷、速效钾均呈极显著正相关关系，说明罗兹菌门对土壤养分反应敏感，这与A和B处理、A和C处理间的差异菌门均包含罗兹菌门的结果相互得到验证。

3.3不同土壤深度真菌生态功能分析

真菌中营养类型以腐生、病原-腐生、病原为主，且随着土壤深度增加腐生类型呈先增后减趋势，病原呈先减后增趋势，病原-腐生逐渐增加。这说明15～25 cm土层适合腐生营养型真菌生存而不适宜病原真菌生存，5～25 cm为病原类型相对较少的土层深度，适合植物生存、生长，这与3.2分析中植物适合生活在浅层土壤中结果一致。

由t-test功能差異检验可得：A与B处理的差异功能营养类型为病原-腐生.B与C处理间为病原、腐生，说明随着土壤深度的增加，营养类型逐渐由兼性（病原-腐生）变为单性（病原、腐生），功能性逐渐单一化。原因可能为：土壤越深，土壤环境变化越趋于稳定，且微生物种类越少，竞争越小，真菌营养类型稳定性越强，变化越少，单一的营养类型足以支撑微生物生存；当土壤越浅时，微生物种类增多，竞争越强，需要足够多的营养类型才能够生存。研究指出病原菌、腐生菌与土壤有较强的相关性，这与本试验结果一致。

4结论

（1）土壤深度与土壤理化性质、真菌群落关系紧密，深度增加，土壤养分含量、群落多样性降低。土壤养分主要集中在5～25 cm土层中，且此土层病原类真菌少，适合植物生存。

（2）随土壤深度增加，真菌群落差异增加，差异变化速率、群落均一性、稳定性降低。

（3）真菌群落门水平以子囊菌门（Ascomyco-ta）、属水平以镰刀菌属（Fusarium，）为主，主要分布在15～35 cm土层中。罗兹菌门对土壤变化反应敏感。

（4）土壤真菌以腐生营养型为主，随着土壤加深，营养类型由兼性向单性转化。