环介导等温扩增技术在畜禽病原微生物检测中的应用及进展

李璐璐，张庆，骆延波，张印，胡明，赵效南，齐静，刘玉庆

（山东省农业科学院畜牧兽医研究所／山东省畜禽疫病防控与繁育重点实验室，山东 济南 250100）

近年来，食源性致病菌引发的食品安全问题对人类健康和社会安全造成了很大威胁。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术由日本学者Notomi等创建，首次报道于2000年，它利用识别多区域特异性引物组和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在65℃左右等温条件下1 h内能扩增出高达109拷贝的靶序列［1，2］。常规实验室检测方法大多耗时长，对仪器设备要求较高，不能够在临床快速检测中普及使用。与常规PCR技术相比，LAMP能满足快速检测的需要。

目前，LAMP方法已经在食品安全检测［3］、快速检测食源性致病菌［4］和水产病害［5］等方面广泛应用。本研究对国内外学者建立的LAMP方法在畜禽业常见病原微生物快速检测中的应用等进行简要概述，旨在为该技术在生产上的应用和推广提供参考。

1 环介导等温扩增技术概况

LAMP的基本原理是在目的双链DNA解链后，内外引物识别相应的位点，在Bst DNA聚合酶作用下延伸。当外引物延伸至内引物处时可以将内引物形成的链置换出来，而后形成哑铃样的DNA结构。该结构再不断被引物识别、延伸和扩增，最终形成一系列大小不一的结构［6］。结果能够通过肉眼直接观察是否具有白色焦磷酸镁沉淀从而进行判断，也可以添加染料进行显色观察。根据这一原理，通常需要根据靶序列设计4～6条引物，随后加入Bst DNA聚合酶在恒温60～65℃条件下30～60 min完成扩增反应。

2 环介导等温扩增技术在畜禽常见病原微生物检测中的应用

2.1 环介导等温扩增技术在大肠杆菌检测中的应用

陈柱［7］和Hill［8］等分别根据大肠杆菌的特异性基因malB建立了LAMP方法。陈柱等建立的LAMP实时浊度法检测大肠杆菌的灵敏度达16.010 ng／L，与实时荧光定量PCR的检测限相当。Hill等则建立了尿液中大肠杆菌的LAMP检测方法，此方法不需要对尿液中大肠杆菌的DNA进行提取，可以直接对尿液样品进行LAMP检测，同时采用碘化丙啶作为染料，其灵敏度可以达到10拷贝／反应。

产志贺毒素大肠杆菌（shiga toxin-producingEscherichia coli，STEC）是一种重要的人畜共患病病原菌，可以引起人类水样腹泻、出血性肠炎等轻度肠不适，严重时可导致溶血性尿毒综合征、终末期肾病甚至死亡。Wang等［9］根据O抗原特异性基因wzx或wzy，对美国STEC感染的七种血清型（O26、O45、O103、O111、O121、O145和O157）建立了LAMP方法，用于碎牛肉、牛肉片、生菜和菠菜中STEC的快速诊断。Dong等［10］建立了针对STEC stx1和stx2的多重LAMP方法，此方法主要通过Tm值把stx1和stx2予以区分，灵敏度达10 fg／μL。此外，研究者对STEC中最常见、危害性最大的O157：H7进行了多项研究，根据O157抗原基因rfbE建立了不同的LAMP方法［11-14］，如LAMP实时浊度法、环介导等温扩增-横向流动试纸条（LAMP-LFD）快速检测方法；Ravan等［15］根据O157：H7特有的Z3276基因中特异性的299 bp建立了LAMP方法，这些LAMP方法的灵敏度大多比普通PCR高10 ～100倍。实时浊度法主要通过浊度仪实时检测LAMP反应过程中产生的白色沉淀，实现对扩增全过程的监控，从而提高引物筛选的效率［11］。LAMP-LFD则依赖于序列之间的特异性进行扩增，避免了非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。此外，操作者只要将扩增产物加入缓冲液中混合均匀，然后将试纸条浸入缓冲液即可，操作简便安全［12］。除建立不同的LAMP方法外，不同研究者对LAMP方法中使用的染料也进行了对比［13，14］。张雪寒等认为，SYBR Green和钙黄绿素相比，钙黄绿素只有在发生LAMP反应时才会产生绿色荧光，而SYBR Green无论是否发生LAMP反应，只要有扩增反应即可显示绿色荧光，大大限制了LAMP方法的广泛使用［13］。

2010年Song等［16］根据ipaH基因建立了针对STEC和侵袭性大肠杆菌（EAEC）的LAMP快速检测方法，检测限为每反应8 cfu。Stratakos等［17］为了快速检测和区分牛肉和牛粪中非致病性大肠杆菌和多细胞毒性大肠杆菌，针对大肠杆菌鉴定基因phoA、stx1、stx2建立了多重LAMP。

LAMP在毒力基因的检测方面也发挥了一定的作用。Kogovšek等［18］针对家禽中危害性最大的禽致病性大肠杆菌（APEC），根据三个毒力基因sitA、traT和ompT建立了LAMP快速检测方法，其最低检测限为1 000 cfu／mL。Jiang等［19］对产肠毒素大肠杆菌（ETEC）的F5菌毛基因建立了LAMP方法，其最低检测限为每管72 cfu，比PCR灵敏度高100倍。

2.2 环介导等温扩增技术在沙门氏菌检测中的应用

沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一。2015年，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）在评估22种细菌、原虫和病毒制剂对全世界食源性疾病的危害时，将沙门氏菌列为首位［20］。世界上第一篇采用LAMP技术检测沙门氏菌的文章发表于2005年［21］，我国最早采用LAMP技术检测沙门氏菌的研究发表于2008年［23］。本研究收集了2005—2019年发表的关于沙门氏菌LAMP检测方法的102篇SCI论文，其中有75篇（73.53%）根据invA基因设计LAMP引物；国内26篇已发表的期刊文章中，20篇（76.92%）根据invA基因设计LAMP检测引物。目前，LAMP在检测沙门氏菌方面已涉及多个领域，包括液态蛋［21，23］、蛋壳［24］、鸡蛋制品［25］、克氏螯虾样品［26］、肉制品［27］、动物饲料［28］、糕点［29］、牛奶［30，31］等。

鲁玉霞［32］、Fang［33］等针对invA基因分别建立了不同的LAMP方法区分活菌和死菌。鲁玉霞等建立了EMA-LAMP方法对食源性沙门氏菌的活菌和死菌进行区分。EMA（叠氮溴乙锭）是一种只能进入具有不完整细胞膜的死细胞中的DNA分子核酸染料。死细胞暴露于EMA 1 min后，EMA就可以渗透细胞壁或者细胞膜与其中的DNA结合，使其不能发生扩增反应。此方法的检测限可以达到每管10-10g DNA，比EMA-PCR方法灵敏度提高100倍［32］。Fang等［33］建立了PMA-LAMP方法，PMA-LAMP和PMA-qPCR检测限均为6.3×102cfu／mL，但在可视化观测死细胞时，PMA-LAMP比PMA-qPCR的特异性和灵敏度更好。

李佳桐［34］、Srisawat［35］等分别根据stn基因建立了沙门氏菌的LAMP检测方法。李佳桐等建立的LAMP方法的最低检测限是10 cfu／mL，比常规PCR灵敏度高1个数量级；Srisawat等建立的LAMP方法的灵敏度为每反应1 cell。田桢干等［36］根据沙门氏菌agfA基因建立了LAMP方法，其灵敏度与RT-PCR方法接近，达到103cfu／mL，比胶体金检测方法灵敏度高100～1 000倍。洪艳等［37］根据沙门氏菌编码DNA解旋酶B亚单位的gyrB基因建立了LAMP方法，灵敏度为6.8×101cfu／mL，能检测到比PCR低10倍的拷贝数。孙园园等［38］根据沙门氏菌高度保守的fimY基因建立了动物饲料中沙门氏菌的快速诊断方法，其最低检出限为6.2 cfu／mL，比PCR方法灵敏度高100倍。

对于某些种类的沙门氏菌，研究者建立了不同的LAMP方法进行检测。例如，对于肠炎沙门氏菌，袁发浒［39］、张海艳［40］等分别根据lygD、SEN1393基因建立了LAMP检测方法，其中袁发浒建立的方法中，细菌培养液检出限为2.33×101cfu／mL，鲜鸡蛋模拟样品的检出限为2.67×101cfu／mL；时建立等［41］根据猪霍乱沙门氏菌β-半乳糖苷酶lacZ基因，建立了猪霍乱沙门氏菌的LAMP检测方法，将细菌DNA稀释到10-8仍可检出，灵敏度是PCR检测法的1 000倍。Gong等［42］根据sefA基因，运用LAMP方法快速检测肉鸡中肠炎沙门氏菌和鸡沙门氏菌，对于肠炎沙门氏菌（ATCC 13076）的纯培养物，LAMP方法的检测限为每反应4 cfu，污染的鸡粪便中LAMP检测限是400 cfu。Fan等［43，44］根据伤寒沙门氏菌特异性标记基因STY1607和STY2879，建立了两种LAMP检测方法，方法均比普通RT-PCR方法灵敏度高10倍。

Ravan等［45］根据prt基因建立了一种LAMPELISA方法，可快速检测D群沙门氏菌，检测限为每管4 cfu，对于人工污染的肉样检测限是103cfu／mL，灵敏度比PCR-ELISA高10倍。Okamura等［46，47］分别对O4型、O9型沙门氏菌建立了LAMP检测方法，其检测限为103cfu／mL，比PCR方法灵敏度提高100倍。

2.3 环介导等温扩增技术在金黄色葡萄球菌检测中的应用

金黄色葡萄球菌是污染食物、引起食物中毒的主要病原菌之一，也是造成临床感染的常见微生物。目前，LAMP方法在金黄色葡萄球菌的快速检测方面已经有了广泛应用，包括食品［48］、猪血［49］、罗 非 鱼［50］、牛 乳［51］、试 验 动 物［52］、冻 鸡肉［53］、粪便［54］等。大多数金黄色葡萄球菌的LAMP方法依据nuc基因建立，并且比PCR方法灵敏度高10～100倍。陈欢等［55］根据nuc基因建立的LAMP-LFD方法灵敏度达1.0×101copy／μL。蔡克周等［49］根据金黄色葡萄球菌的femA基因建立的LAMP方法用于猪血中金黄色葡萄球菌的快速检测，其检测限为8.7 cfu／mL，灵敏度比PCR方法高1 000倍。徐义刚等［56］根据金黄色葡萄球菌高度保守的Sa442基因建立的LAMP方法灵敏度为25 cfu／mL，比PCR方法灵敏度高10倍。Wang等［57］为同时检测粪肠球菌和金黄色葡萄球菌，运用Ef0027基因和nuc基因，建立了LAMPLFB（LAMP-侧向流生物传感器）方法，血液样品经过75 min即可判断结果，且准确可靠。Lim等［58］根据金黄色葡萄球菌arcC基因建立了一种LAMP方法，并且与根据spa、arcC基因建立的PCR方法进行了比对，LAMP方法检测限为2.5 ng／μL和102cfu／mL，PCR方法检测限分别为12.5 ng／μL和103cfu／mL。

近年来，金黄色葡萄球菌的耐药性问题日趋严重，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA），几乎对所有的抗菌药物均有不同程度的耐药，成为严重威胁世界公共卫生的一个重大问题。能否快速准确地确定是否为MRSA感染，以便选择合适有效的抗菌药物用于治疗，对于临床治疗非常迫切。Su等［59］根据orfX基因建立了一种快速检测MRSA的LAMP方法，检测限为每反应10 cfu。Nawattanapaiboon等［60］根据femB基因和mecA基因建立了LAMP-LFD方法，根据mecA基因建立的方法检测限为10 pg DNA或100 cfu／mL。Chen等［61］根据mecA、nuc和femB基因建立了一种用于MRSA快速诊断的LAMP方法，并且为了便于肉眼观察，在反应体系中加入了HNB（羟基萘酚蓝）。Lin等［62］则根据16S rRNA、femA、mecA和orfX建立了LAMP方法，可对医院呼吸道样本中MRSA进行快速诊断，其中利用16S rRNA、femA、mecA基因的检测限均为104cfu／mL，利用orfX基因的检测限为105cfu／mL。此外，Yin等［63］根据金黄色葡萄球菌肠毒素基因sea和seb建立了多重LAMP方法，检测限为102cfu／mL，比PCR方法灵敏度高10倍；对经过孵育6 h后的牛奶、苹果汁、奶酪和大米的检测限均为1 cfu／mL。

2.4 环介导等温扩增技术在其他病原菌检测中的应用

除了大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌以外，研究者还对铜绿假单胞菌［64］、副猪嗜血杆菌［65］、猪链球菌［66］、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌［67］、李斯特菌［68，69］等建立了不同的LAMP方法。

3 结语

环介导等温扩增技术是一种具有突破性的、较为便捷和快速的核酸检测方法。与传统的检测方法相比，具有较高的特异性，且灵敏度比常规PCR高10～100倍。其突出优势在于检测所需时间短、无需昂贵的仪器、检测结果可视化。目前，环介导等温扩增技术已经和常规PCR、实时荧光定量PCR等共同成为常规检测的主要工具。但是LAMP技术也存在一些缺陷。由于LAMP引物设计一般针对靶基因的4～6个区域，引物的设计比较复杂且受到限制，同时LAMP引物设计软件对靶基因的长度有要求，因此需要人工参与引物设计，需要一定的专业基础；多个引物的使用虽然提升了特异性，但同时也增加了引物之间的杂交概率，容易产生假阳性结果；此外，LAMP的反应产物非常稳定，不易降解，易形成气溶胶污染，且LAMP反应的灵敏度极高，即使极少量的阳性产物也会对结果产生影响，这就对操作人员、操作过程提出了较高的要求。

由于LAMP易于适应任何现场环境，且具有实时检测所需的所有特性，未来随着便携式LAMP产品的进一步发展，以及与其它多种技术的结合，LAMP在临床微生物检测领域的应用范围会更加广泛，为基层企业的病原微生物检测提供了有价值的工具，不仅能够降低病原微生物的检测成本，同时还能有效地进行早期控制，避免更多的经济损失。因此，LAMP未来的研究、应用发展方向可集中在研发集成式、体积小、操作便捷、直接检测样本、通量高、易判读、低费用的手持式检测仪。