致病性镰孢菌入侵对土壤微生物群落和功能的影响

王庆华，付学松，田叶韩，高克祥，申洋，吕新民，李洋

（1.泰安市徂徕山林场，山东 泰安 271000；2.山东农业大学植物保护学院，山东 泰安 271018；3.山东农大肥业科技有限公司，山东 泰安 271000）

尖镰孢菌（Fusarium oxysporum）广泛存在于世界各地的原生土壤中，从植物根部和非生物体有机质中均能够发现尖镰孢菌，这表明其为尖镰孢菌生长和繁殖提供了生态位点和资源［1，2］。土壤中的尖镰孢菌一般不会引起土著植物群落病害的发生。尖镰孢菌是一种腐生能力非常强的丝状真菌，一旦成功在土壤中定殖几乎不可能消除［3，4］。

土壤微生物区系如微生物生物量、群落、多样性和特定微生物群的丰富性被认为对维持土壤健康、质量、酶活性和疾病抑制至关重要［5，6］。土壤微生物多样性高和微生物区系保持动态平衡是抑制病原菌入侵的重要基础，长期连作会导致土壤中病原微生物积聚，成为优势种群，最终导致土壤微生物区系失衡。同时，土壤对病原微生物的抵御能力与很多农业管理措施密不可分，轮作可增强土壤微生物区系的多样性，增强土壤微生物群落对病原菌侵入的抵抗力［7］。研究表明，青枯病菌（Ralstonia solanacearum）和枯萎病菌（F.oxysporum）等病原菌在入侵过程中会引起土壤原著微生物群落剧烈变化，表现为植物病原微生物增加以及微生物多样性和群落功能改变［8］。土壤真菌丰度和多样性与枯萎病的发生呈显著正相关，常年集约化单作栽培，导致土壤真菌的丰度和多样性上升，细菌的丰度和多样性降低，土壤微生物区系抵御镰孢菌侵入的能力降低，最终导致镰孢菌在土壤中成功定殖和积累［9］。在枯萎病高发区的土壤中镰孢菌丰度高于非致病性土壤，同时，真菌或细菌丰度和多样性也高于非致病性土壤［8］。但是，到目前为止，关于尖镰孢菌在其介导的微生物群落组成和多样性变化以及土壤质量下降中的作用还不是很清楚。本试验拟研究致病性镰孢菌入侵土壤后对土壤微生物群落和功能的影响，以期为作物枯萎病的生物防治策略提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

尖镰孢菌苦瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.momordicae，ACCC 39204）SG-15菌株。

1.2 试验方法

1.2.1 尖镰孢菌入侵模型制备 本研究通过人工向土壤中添加尖镰孢菌制备其入侵模型：（1）用马铃薯葡萄糖液体培养基扩繁高致病性SG-15菌株获得病原菌孢子悬浮液，将孢子悬浮液用自来水稀释100倍后按1∶1的质量比与草炭土混匀，继续进行二次扩繁，孵育30 d，将含病原菌草炭土（浓度为104cfu/g）均匀撒入病圃中（1 kg/m2），旋耕整地。（2）连作苦瓜，每年种植两茬，连续种植5年。

1.2.2 病菌SG-15入侵对微生物群落组成和功能的影响试验 以未接种SG-15菌株地块内的苦瓜根际土壤为空白对照组（Control），人工病圃内苦瓜根际土壤为处理组（S-FOM），每处理重复5次。通过微生物宏基因组研究尖镰孢菌入侵对土壤微生物群落组成和功能的影响。

1.2.3 宏基因组测序 采用CTAB法提取样本基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度，取适量样品于离心管中，用无菌水稀释样品至1 ng/μL。

基于Illumina HiSeq高通量测序平台，采用全基因组鸟枪法（whole genome shotgun，WGS）将提取获得的菌群宏基因组总DNA随机打断为短片段，并构建合适长度的插入片段文库，对这些文库进行双端（paired-end，PE）测序。对高质量测序数据进行从头（de novo）组装拼接，构建Contigs和Scaffolds序列，并对生成的Contigs和Scaffolds序列进行组装拼接效果评价。采用MetaGeneMark数据库预测原核微生物和宏基因组的基因序列，并识别开放阅读框（ORF），获得对应的蛋白序列。使用每个样本的Scaffolds序列与NCBI-NT数据库中的细菌（bacteria）、古菌（archaea）、真菌（fungi）和病毒（viruses）序列进行BLASTN比对（E值设定为＜0.001）。通过MEGAN软件中“最低共同祖先（LCA）”算法将参考序列分化为不同物种分枝前的最后一级共同分类，结合Scaffolds/Scaftigs序列在各样本中的丰度（深度）数据，获得各样本在各个分类等级（界、门、纲、目、科、属、种）上的相对丰度分布表。

2 结果与分析

2.1 病原菌SG-15对土壤微生物群落组成的影响

Control处理中细菌平均占比90.06%（放线菌占比20.34%），真菌占比0.1512%；S-FOM处理中细菌平均占比89.46%（放线菌占比19.62%），真菌占比0.1469%（图1A）。与Control处理相比，S-FOM处理土壤中的真菌和细菌占比降低，但是除放线菌外的细菌种群的总体占比上升。

在微生物门水平，健康土壤和致病性土壤组成相似，但相对丰度存在差异。变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单 胞 菌门（Gemmatimonadetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）及拟杆菌门（Bacteroidetes）是土壤中细菌丰度最高的门，占微生物总序列的62.96%；与健康土壤（Control）相比，致病性土壤（S-FOM）中变形菌门、厚壁菌门和硝化螺旋菌门的相对丰度上升（P＞0.05），放线菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门和浮霉菌门的丰度显著下降（P＜0.05）（图1A、B）。子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）是土壤中真菌丰度最高的门，占土壤微生物总序列的0.14%，占土壤真菌总序列的95.98%；与健康土壤（Control）相比，致病性土壤（S-FOM）中担子菌门的丰度显著下降（P＜0.05）（图1C）。

在微生物属水平上，主要土壤微生物的相对丰度存在显著差异。与健康土壤（Control）相比，致病性土壤（S-FOM）中曲霉菌属（Aspergillus）、刺盘孢属（Colletotrichum）、孢堆黑粉菌属（Sporisorium）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、红游动菌属（Rhodoplanes）、Gemmatirosa、中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）、溶杆菌属（Lysobacter）、堆囊菌属（Sorangium）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、链霉菌属（Streptomyces）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、小单孢菌属（Micromonospora）、游动放线菌属（Actinoplanes）、分枝酸杆菌属（Mycolicibacterium）、拟无枝酸菌属（Amycolatopsis）、弗兰克氏菌属（Frankia）、假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）和伊卢玛托菌属（Ilumatobacter）的相对丰度显著下降（P＜0.05），镰孢菌属（Fusarium）、壤霉菌属（Agromyces）、贪噬菌属（Variovorax）、拉姆利菌属（Ramlibacter）和克里布所菌属（Kribbella）的相对丰度显著上升（P＜0.05）（图1D、E、F）。

图1 病原菌SG-15对土壤主要微生物群落组成的影响

2.2 病原菌SG-15对关键土壤微生物群落和功能的影响

随机森林分析（random forest）和LEfSe分析（LDA effect size）结果表明，迷踪菌门（Elusimicrobia）、奇古菌门（Thaumarchaeota）、Euglenida菌门、Candidatus Wolfebacteria菌 门、Candidatus Beckwithbacteria菌门、Candidatus Saccharibacteria菌门、子囊菌门、广古菌门（Euryarchaeota）、软壁菌门（Tenericutes）、变形菌门、放线菌门及变形菌门内的塔特洛克菌属（Tatlockia）、拉姆利菌属（Ramlibacter）、极地单胞菌属（Polaromonas）、塔特亚玛利亚菌属（Tateyamaria）、假古尔本基安菌属（Pseudogulbenkiania）、福格斯氏菌属（Vogesella）、脱硫橄榄状菌属（Desulfobacca）、假单胞菌属（Pseudomonas）和放线菌门的壤霉菌属（Agromyces）等微生物种群对致病性土壤（S-FOM）中的微生物群落结构差异具有关键的影响作用（图2A、B）。在致病性土壤中，氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）、嘧啶代谢（pyrimidine metabolism）、遗传信息处理（genetic information processing）、丙酮酸代谢（pyruvate metabolism）、嘌呤代谢（purine metabolism）、细菌分泌系统（bacterial secretion system）、能量代谢（energy metabolism）、核苷酸代谢（nucleotide metabolism）和氮代谢（nitrogen metabolism）等代谢功能显著富集，而细菌群体感应（quorum sensing）和外源性物质降解和代谢（xenobiotics biodegradation and metabolism）等功能显著降低（图2C）。

图2 差异关键微生物和代谢功能分析

2.3 病原菌SG-15对氮素循环的影响

在Control与S-FOM两组处理中共发现49个与氮素循环相关的土壤微生物基因，其中12个基因的相对丰度在致病性土壤中降低，涉及固氮作用、硝化作用和反硝化作用的22个基因的丰度水平在致病性土壤中显著上升（图3A），土壤尖镰孢菌相对丰度与gltD、nirB、nirK、narG、narH、nasA、nosZ、CA、cynS、napA、napB、NRT、nifH、nifK、norB、NR、hao、pmoCamoC、GDH2、nrtA和nirS共21个基因呈显著正相关（P＜0.05），与RocG、nirD、nirA和NIT6呈显著负相关（P＜0.05）（图3B）。另外，nirB、nasA、napB、NRT、norB和nirS基因与土壤脲酶呈现显著正相关（P＜0.05），gltD、nasB、nirB、napA、napB、NRT、nifH、norB和nirS基因与土壤有效氮含量呈现显著正相关（P＜0.05）（图3C）。在S-FOM和Control中注释到的与氮代谢相关的微生物包括10个门、164个属和299个种，其中变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门和浮霉菌门为主要微生物门，占已知微生物的60%、22%、3%、2%和2%（图4A、B）。在种水平，未分类的放线菌（unclassified Actinobacteria）、未分类根瘤菌（unclassified Rhizobiales）和未分类的假单胞菌（unclassified Pseudomonas）的丰度水平在S-FOM处理中显著上升（P＜0.05）（图4C）。

图3 菌株SG-15对氮素代谢相关基因的影响

图4 与氮素代谢相关的微生物种群丰度

3 讨论与结论

植物病原菌如青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）和尖镰孢菌入侵土壤后，会引起土壤微生物组的剧烈变化，导致土壤质量下降，表现为植物病原菌的增加和微生物多群落功能的丧失［8］。镰孢菌作为病原菌、内生菌和腐生菌在土壤和植物中扮演着重要的功能角色，尖镰孢菌在土壤中的定殖可能会降低有益细菌的数量和/或活性，最终导致土壤对枯萎病的抑制力下降。Shen等［9］研究表明，放线菌门和厚壁菌门的微生物相对丰度与较低的枯萎病发病率和较高的植物生物量显著相关。在香蕉枯萎病高发土壤中，尖镰孢菌的丰度、真菌或细菌的丰富度和多样性均高于健康土壤［8］。本研究中，尖镰孢菌的入侵引起了土壤微生物群落丰富度和群落结构的剧烈变化，未引起总微生物多样性的显著变化，但真菌和放线菌的多样性降低。在门水平上，尖镰孢菌的入侵降低了放线菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门和浮霉菌门的相对丰度，提高了变形菌门、厚壁菌门和硝化螺旋菌门的相对丰度。在属水平上，入侵的尖镰孢菌与Bradyrhizobium、Streptomyces、Luteitalea、Sphingomonas、Rhodoplanes、Cordyceps、Gemmatirosa、Aspergillus、Rhodotorula、Colletotrichum、Anthracocystis、Trichoderma、Thielavia和Cladophialophora等优势土著微生物存在生态位点和资源的竞争，尖镰孢菌的入侵显著压迫了优势微生物群落的生存空间，同时也激活了Kribbella、Streptomyces、Devosia、Burkholderia、Variovorax、Agromyces、Ramlibacter和Pseudomonas属内有益微生物的生长繁殖（未发表）。Chapelle等［10］研究表明，入侵的立枯丝核菌（R.solani）可直接或通过植物诱导根际细菌群落的胁迫反应，导致土壤微生物群落组成的变化，并激活限制病原菌侵染的有益微生物种群的生长繁殖，立枯丝核菌入侵后，Oxalobacteraceae、Burkholderiaceae、Sphingobacteriaceae和Sphingomonadaceae在根际环境中的含量明显增加。

土壤微生物通过代谢促进土壤养分的形成和转化［11，12］。土壤-微生物-土壤养分作为土壤物质循环和能量流动的统一体，相互影响和制约，土壤养分输入的种类、数量及分解过程中物质的变化均会影响土壤微生物群落组成和活性，而微生物群落的变化反过来又会影响土壤养分的分解和转化［13-16］。本研究发现尖镰孢菌入侵对土壤中氮素代谢和细菌群体感应等功能具有显著影响。同时，尖镰孢菌定殖对链霉菌属、鞘氨醇单胞菌属、假单胞菌属和慢生根瘤菌属等与氮素代谢和细菌群体感应功能相关的微生物丰度影响较大。Stone等［17］研究表明，慢生根瘤菌、酸杆菌和链霉菌等在利用现有的土壤碳和添加到土壤中的营养物质方面比其它较罕见的微生物要好，当添加碳和氮时，这些已经占主导地位的细菌巩固了其对养分的控制，相对于其他存在的分类群生长得更快。Zhou等［8］研究表明，发生枯萎病的土壤中总有机碳、总有机氮和速效钾的含量显著高于健康土壤。众多的研究结果表明，在枯萎病致病性土壤中，尖镰孢菌的入侵破坏了土壤的养分循环，其原因有可能是尖镰孢菌抑制植物的正常生长，阻碍了土壤中养分的输出。

尖镰孢菌是一种典型的土壤习居菌。本研究表明，外源尖镰孢菌可通过改变链霉菌属和慢生根瘤菌属等土壤优势微生物的群落多样性，干扰土壤养分转化，为自身创造更有利的生存环境。