响应面优化花生蛋白抗菌肽制备工艺

江晨，齐宏涛，于丽娜，彭娅萍，杨伟强，毕洁，王明清，孙杰，，宋昱

（1.山东省花生研究所，山东 青岛 266100；2.青岛大学生命科学学院，山东 青岛 266071）

花生含有25%～36%的蛋白质，而花生粕含有约50%的优质蛋白质［1］。花生粕经不同的提取技术可以得到花生浓缩蛋白、分离蛋白、磷酸化改性蛋白、限制性酶解蛋白、糖基化改性蛋白、磷酸化改性蛋白膜等多种花生蛋白精深加工产品［2-7］，应用在不同的食品领域。此外，花生蛋白还可以进一步制备成抗氧化肽、血管紧张素抑制活性肽（ACE抑制肽）、α-葡萄糖苷酶抑制活性肽、醒酒肽、抗菌肽等不同生理功能的花生蛋白肽产品［8-12］，提高花生蛋白的附加值。

抗菌肽分为内源和外源抗菌肽两大类，内源抗菌肽由生物体内提取［13］，外源抗菌肽由化学合成法、基因工程法、微生物发酵法和酶解法获得［14-17］。由于酶解法具有反应条件温和、无有机试剂和有毒化学品残留、酶解效率和产物活性高的特点，已成为食品和天然产物领域制备抗菌肽的主要方法。大多数抗菌肽分子量小于10 kDa，存在于动物或植物蛋白序列中，经蛋白酶水解后成为有活性的抗菌肽。目前，一些学者制备了植物源蛋白酶解的抗菌肽如花生蛋白抗菌肽［12］、棉籽蛋白抗菌肽［17］、紫苏蛋白抗菌肽［18］、苦荞蛋白抗菌肽［19］等，这些抗菌肽一般具有广谱抗菌活性。本研究拟采用超声波辅助Alcalase（碱性蛋白酶）酶解花生蛋白制备花生抗菌肽复合物，以对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和米曲霉的抑菌率作为考察指标，优化花生抗菌肽的制备工艺，旨在为花生抗菌肽的分离、纯化和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低温冷榨花生蛋白粉，青岛长寿食品有限公司；碱性蛋白酶（Alcalase，2.4 L，标称活力2.4 AU·mL-1），丹麦诺维信生物技术有限公司；LB和PDA固体培养基，青岛生工生物科技有限公司；大肠杆菌（菌种编号CICC 10354）、枯草芽孢杆菌（菌种编号CICC 10732）、米曲霉（菌种编号CICC 2026），购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 仪器与设备

FR223CN型电子分析天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）；L420型低速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；KQ-300GVDV型台式三频恒温数控超声波清洗器（上海右一仪器有限公司）；FE20型实验室pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）；VORTEX-GENIE2T型漩涡混合器（美国Scientific Industies公司）。

1.3 超声波辅助Alcalase酶解花生蛋白制备花生抗菌肽复合物工艺

取花生蛋白粉放入50 mL塑料离心管中，加入蒸馏水，漩涡混合器混匀；用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值，加入Alcalase酶，再加入蒸馏水到离心管指定刻度，漩涡混合器混匀；调节温度、超声波频率、超声波功率，在超声波清洗器中超声辅助酶解一定时间；酶解结束后在沸水浴中灭酶5 min，立刻在冷水浴中冷却；然后以4 000 r/min离心10 min，上清液倒入三角瓶中；再向三角瓶中倒入4倍于上清液体积的无水乙醇，摇动三角瓶使上清液与无水乙醇混合均匀，将三角瓶贮存于4℃冰箱中，静置12 h后，以4 000 r/min离心15 min，上清液倒入旋转蒸发瓶，在50℃、真空条件下蒸发除掉乙醇，旋转蒸发瓶内液体定容至50 mL，待用。

1.4 超声波辅助Alcalase酶解花生蛋白制备花生抗菌肽复合物优化试验设计

1.4.1 单因素试验 以底物浓度、初始pH值、加酶量、反应温度、反应时间、超声波频率、超声波功率作为试验因素，以对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和米曲霉的抑制率作为考察指标进行试验设计，每组试验做3个平板平行试验，取抑制率平均值作为试验结果。试验因素的水平见表1。

表1 单因素试验因素水平

1.4.2 响应面（response surface methodology，RSM）试验设计 在单因素试验基础上，固定反应时间40 min、超声波功率210 W、超声波频率28kHz，以底物浓度（X1）、pH值（X2）、加酶量（X3）和温度（X4）4个因素为自变量，运用Box-Benhnken试验设计，进行四因素三水平的响应面分析试验，以对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和米曲霉的抑菌率作为响应变量（Y1、Y2和Y3）。各因素的编码和水平见表2。

表2 响应面法分析试验因素水平

1.5 抑菌率的测定

将灭菌的LB和PDA固体培养基倒在培养皿中，待其凝固。用接种环分别挑取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和米曲霉的斜面菌种各1环，分别放入灭菌的生理盐水中，混合均匀，得到3种菌的菌悬液。用灭菌枪头分别吸取大肠杆菌和枯草芽孢杆菌菌悬液各1 mL到LB平板表面，再取米曲霉菌悬液1 mL到PDA平板表面，用涂布棒将菌悬液涂布均匀。待菌悬液干燥后，以“十”字方式在平板中央和外周摆5个牛津杯。中央的牛津杯内加入灭菌的生理盐水，四周的牛津杯内加入相应的花生抗菌肽复合物。培养皿封口，放到培养箱静置培养。大肠杆菌和枯草芽孢杆菌37℃培养24 h，米曲霉28℃培养48 h。培养结束后，测量抑菌圈的直径，抑菌率（%）=抗菌肽抑菌圈直径（mm）/生理盐水对照组细菌圈直径（mm）×100。

1.6 统计分析

响应面试验设计与分析采用Design-Expert（8.0）软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 底物浓度对花生抗菌肽复合物抑菌活性的影响 图1A所示，花生抗菌肽复合物对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌率高于米曲霉。随着底物浓度增大，花生抗菌肽复合物对枯草芽孢杆菌的抑菌率逐渐增大，最大值出现在底物浓度12%；而对大肠杆菌和米曲霉的抑菌率先增大后减小，最大值都出现在底物浓度8%时。因此，选择底物浓度8%～12%作为响应面试验因素水平。

2.1.2 pH值对花生抗菌肽复合物抑菌活性的影响 蛋白酶水解活性受到反应体系pH值的影响。随着pH值的增大，花生抗菌肽复合物对3种菌的抑菌率都呈增大趋势（图1B），且在pH值8.0～9.0范围内，抑菌率较大，具有较好的活性。因此，选择pH值8.0～9.0作为响应面试验因素水平。

图1 底物浓度（A）和pH值（B）对花生抗菌肽复合物抑菌活性的影响

2.1.3 加酶量对花生抗菌肽复合物抑菌活性的影响 花生抗菌肽复合物对3种菌的抑菌率均呈先减小后增大趋势（图2A）。当加酶量为19.2AU·L-1时，对3种菌的抑菌率均最小，然后逐渐增大到最大值。加酶量23.0～30.6 AU·L-1的抑菌率总体较高，因此选作响应面试验因素水平。

图2 加酶量（A）和温度（B）对花生抗菌肽复合物抑菌活性的影响

2.1.4 温度对花生抗菌肽复合物抑菌活性的影响 在40～65℃范围内，对枯草芽孢杆菌的抑菌率，变化幅度较平缓，对大肠杆菌的抑菌率呈波动变化，对米曲霉的抑菌率总体呈现先减小后增大趋势；对3种菌的抑菌率都在55℃时最小（图2B）。鉴于大肠杆菌和米曲霉的抑菌率在40、50、60℃时较好，而枯草芽孢杆菌的抑菌率变化较小，将40～60℃作为响应面试验因素水平。

2.1.5 时间对花生抗菌肽复合物抑菌活性的影响 在10～60 min反应时间内，对枯草芽孢杆菌的抑菌率先减小后增大，40 min后趋于平稳，对大肠杆菌和米曲霉的抑菌率都是先增大后减小；对3种菌的抑菌率都在反应40 min时最大（图3A）。因此，将40 min作为响应面试验固定因素水平。

图3 反应时间（A）和超声波频率（B）对花生抗菌肽复合物抑菌活性的影响

2.1.6 超声波频率对花生抗菌肽复合物抑菌活性的影响 花生抗菌肽复合物对3种菌的抑菌率都呈先减小后增大的趋势，最大值都出现在超声波频率为28 kHz时（图3B）。因此，将超声波频率28 kHz作为响应面试验固定因素水平。

2.1.7 超声波功率对花生抗菌肽复合物抑菌活性的影响 超声波功率在150～300 W范围内，花生抗菌肽复合物对枯草芽孢杆菌和米曲霉的抑菌率都呈现先增大后减小再增大的趋势，对大肠杆菌的抑菌率为先增大后减小的趋势；对3种菌的抑菌率都在210 W取得最大值（图4）。因此，将超声波功率210 W作为响应面试验固定因素水平。

图4 超声波功率对花生抗菌肽复合物抑菌活性的影响

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 模型的建立与方差分析 根据RSM设计29组试验（表3），经二次多项式回归拟合，获得了相应预测值与底物浓度（X1）、pH值（X2）、加酶量（X3）和温度（X4）的二次回归方程，如下：

表3 RSM设计及结果

方差分析结果（表4）表明，3个模型的P值均小于0.001，失拟项的P值均大于0.05，信噪比（Adeq Precision）均大于4，模型均具有统计意义，分辨力较高，可用于对不同制备条件下的抑菌率进行预测。3个模型的相关系数（R）分别为0.9916、0.9891、0.9896，矫正决定系数（）分别为0.9664、0.9568、0.9587，预测离差平方和分别为0.9574、0.9429、0.9093，，且变异系数（CV）分别为2.18%、1.75%、2.73%，均小于10%，说明模型变异小，拟合优度好，可用于对花生蛋白抗菌肽制备工艺的初步分析和预测。

表4 回归模型方差分析

2.2.2 模型回归系数的显著性检验与各因素间交互作用 由表5可见，枯草芽孢杆菌模型中，X3对抑菌率的线性效应极显著和对抑菌率的曲面效应极显著；X1X2、X1X3、X2X3和X2X4对抑菌率的交互影响极显著，X3X4对抑菌率的交互影响显著。大肠杆菌模型中，因素X1和X2对抑菌率的线性效应极显著，X3对抑菌率的线性效应高度显著和对抑菌率的曲面效应极显著，对抑菌率的曲面效应显著；X1X3、X2X3和X3X4对抑菌率的交互影响极显著，X1X2对抑菌率的交互影响显著。米曲霉模型中，因素X1、X2和X4对抑菌率的线性效应极显著，X3对抑菌率的线性效应高度显著和对抑菌率的曲面效应极显著，对抑菌率的曲面效应高度显著；X1X2、X1X3、X2X3和X3X4对抑菌率的交互影响极显著，X2X4对抑菌率的交互影响高度显著。由3个响应面模型回归方程可以看出，在影响抑菌率的因素中，底物浓度和加酶量与抑菌率呈正相关，pH值和温度与抑菌率呈负相关。通过比较一次项的方差大小，可以判断出：枯草芽孢杆菌模型中，各因素对抑菌率影响程度为X3＞X4＞X1＞X2；大肠杆菌模型中，各因素对抑菌率影响程度为X1＞X2＞X3＞X4；米曲霉模型中，各因素对抑菌率影响程度为X1＞X2＞X4＞X3。

表5 回归方程系数显著性检验

两两因素对花生抗菌肽复合物抑菌率的响应曲面图见图5、图6、图7。曲面弯曲程度越大，曲线越陡，影响越显著。

图5 因素间交互作用对花生抗菌肽复合物抑菌率的响应曲面图（枯草芽孢杆菌）

图6 因素间交互作用对花生抗菌肽复合物抑菌率的响应曲面图（大肠杆菌）

图7 因素间交互作用对花生抗菌肽复合物抑菌率的响应曲面图（米曲霉）

2.2.3 最佳酶解参数的确定和验证 对实验模型进行典型性分析，获得超声波辅助Alcalase酶解制备花生蛋白抗菌肽的最优条件为底物浓度10.9%、pH值8.26、加酶量26.6 AU·L-1、温度48.3℃，花生蛋白抗菌肽对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和米曲霉抑菌率理论值分别为130.7%、130.4%和85.4%。为检验响应面方法的可行性，并综合考虑实际操作的便利性，将工艺参数修正为底物浓度10.9%、pH值8.3、加酶量26.6AU·L-1、温度48℃，3次平行试验得到的花生蛋白抗菌肽对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和米曲霉抑菌率分别为132.9%±0.4%、128.6%±0.6%和84.1%±0.8%，与理论值的差异幅度分别为1.68%、1.38%和1.52%，都在2%以内，说明模型拟合效果较好，精确度较高。因此，响应面法对超声波辅助酶解制备花生蛋白抗菌肽工艺条件的参数优化是可行的，得到的工艺条件具有实际应用价值。

3 讨论与结论

目前，采用蛋白酶水解方法制备抗菌肽的植物蛋白来源主要有条斑紫菜［20］、螺旋藻［21］、坛紫菜［22］、海带［23］等海藻类蛋白，以及花生［12］、棉籽［17］、紫苏［18］、核桃［24］等脱脂饼粕类蛋白。其中，螺旋藻、海带、花生、棉籽和紫苏蛋白的水解采用碱性蛋白酶，坛紫菜和核桃蛋白的水解用胃蛋白酶，条斑紫菜蛋白水解用木瓜蛋白酶。这些蛋白水解后得到的抗菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌等G-以及金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和链球菌等G+具有抑菌活性。大多数抗菌肽中有一定的疏水性氨基酸残基，而碱性蛋白酶能高效地水解蛋白肽链中羧端疏水性氨基酸，从而得到具有疏水性氨基酸的短肽［25］。在抗菌肽抑菌过程中，这些疏水基团易与菌体脂质结合，亲水基团易与水结合，通过疏水基团和亲水基团的相互协作实现抑菌活性［26］。基于此，本研究采用超声波辅助碱性蛋白酶水解花生蛋白，得到了对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和米曲霉都有抑菌活性的抗菌肽。

采用单因素试验和响应面试验对超声波辅助碱性蛋白酶酶解制备花生抗菌肽复合物的工艺进行优化，得到最优工艺条件为底物浓度10.9%、初始pH值8.3、加酶量26.6 AU·L-1、超声波功率210 W、超声波频率28 kHz、反应体系温度48℃、反应时间40 min，此条件下制备的花生抗菌肽复合物对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和米曲霉抑菌率分别为132.9%±0.4%、128.6%±0.6%和84.1%±0.8%。本研究为今后花生抗菌肽的分离纯化、生物活性、构效关系以及分子改造等研究提供了理论依据。