禽类三种常见病原菌快速检测体系的建立及应用

任金瑞，李均同，赵效南，吴香菊，王曦，丛晓燕，戴美学，杜以军，刘玉庆，齐静

（1.山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250014；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疾病防治与繁育重点实验室，山东 济南 250100）

中国肉鸭数量和肉鸭产业位居世界第一［1］。鸭疫里默氏杆菌是水禽特别是肉鸭养殖中最重要的细菌性疾病之一，主要引起1～8周龄特别是2～3周龄雏鸭发病和死亡，并以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎等为病理特征，死亡率达50%左右，与大肠杆菌引起的临床特征非常相似，且二者的混合感染现象非常严重［2-5］；该菌也会导致5～17周龄鹅感染（感染率9.9%）和12～19周龄火鸡发病（发病率0.5%）［6］。大肠杆菌和沙门氏菌对鸡、鸭、鹅等家禽的混合感染也非常普遍和严重［7-10］。这3种革兰氏阴性致病菌血清型众多且宿主范围广，给禽类养殖带来巨大的危害和经济损失，是禽类感染的常见重要病原菌。由这些病原菌导致相关食源性感染危及人类公共卫生安全，因此建立一套这3种常见病原菌单一或混合感染的快速检测体系意义重大。

PCR技术在临床诊断中的应用已较为广泛［11-13］，多重PCR检测方法也得到了快速发展和应用［14，15］，该技术检测成本低、效率高，可实现核酸水平上疾病的快速检测和诊断。因此，本试验通过选择鸭疫里默氏杆菌的ompA、大肠杆菌的phoA和沙门氏菌的fimW保守基因的特异性引物，构建了多重PCR检测体系，优化了引物的退火温度和使用浓度等反应条件，检测了其特异性和敏感性，并在临床样本中进行了吻合性检测，实现了从临床病料中直接、快速、准确诊断这3种病原菌的单一或混合感染，以期防控细菌性疾病感染，减少对养禽业造成的经济损失。

1 材料与方法

1.1 菌株

1.1.1 标准菌株 大肠杆菌ATCC 25922和沙门氏菌ATCC 13076，购自美国菌种保藏中心；鸭疫里默氏杆菌Ra50，2018年从四川病鹅的肝脏中分离并经质谱鉴定，由本实验室保存。

1.1.2 特异性检测所用菌株 铜绿假单胞菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌ATCC 29213，购自美国菌种保藏中心；肺炎克雷伯氏菌、猪链球菌、魏氏梭菌、屎肠球菌、粪肠球菌，均由本研究室分离、质谱鉴定并保存。

1.2 试验方法

1.2.1 引物选择 检测鸭疫里默氏杆菌选择林树乾等［11］根据ompA基因序列设计的引物，检测大肠杆菌选择许一平等［14］根据phoA基因序列设计的引物，检测沙门氏菌选择张富友等［12］根据fimW基因序列设计的引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌各自保守基因PCR引物序列

1.2.2 菌株DNA提取及在DNA和菌水平的定量 鸭疫里默氏杆菌Ra50接种于4 mL TSB培养基中（含2%胎牛血清），置5%CO2摇床上，37℃、200 r/min培养16 h；大肠杆菌ATCC 25922和沙门氏菌ATCC 13076分别接种于4 mL LB培养基中，37℃摇床200 r/min培养16 h。培养液10 000 r/min离心5 min，收集沉淀，水煮法提取基因组DNA，Nanodrop 2000分光光度计测定其DNA浓度，微量平板计数法测定菌落数量［16］。

1.2.3 单一PCR体系的验证 将3种细菌基因组DNA用ddH2O稀释至50 ng/μL作为模板，对表1中的引物分别进行单一PCR体系的验证。PCR反应体系：10×reaction buffer（20 mmol/L Mg2+plus）2.5μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2.0 μL，上、下游引物（10μmol/L）各1.0μL，rTaq（5 U/μL）0.2μL，细菌DNA模板（50 ng/μL）1.0 μL，ddH2O补足至25μL。PCR反应条件：95℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，30个循环；72℃10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 多重PCR体系的组装和引物浓度的优化将3对引物ompA F/R、phoA F/R、fimWF/R按以下5种终浓度（μmol/L）组合配制三重PCR体系：0.4、0.4、0.4，0.6、0.2、0.2，0.60、0.20、0.28，0.60、0.28、0.28，0.60、0.28、0.20，3种细菌DNA模板（50 ng/μL）各1μL，10×reaction buffer（20 mmol/L Mg2+plus）2.5μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2.0μL，rTaq（5 U/μL）0.2μL，ddH2O补足至25μL。在55℃退火温度下进行PCR扩增，PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 多重PCR体系退火温度的优化 按最佳引物对的终浓度量添加3对上、下游引物（10μmol/L），3种细菌DNA模板（50 ng/μL）各1 μL，10×reaction buffer（20 mmol/L Mg2+plus）2.5 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2.0μL，rTaq（5 U/μL）0.2μL，ddH2O补足至25μL。退火温度为53～63℃，温度梯度为1℃，按1.2.3中单一PCR反应条件进行扩增，PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 多重PCR体系的特异性检测 用细菌基因组DNA提取试剂盒（杭州博日科技股份有限公司）说明书分别提取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、猪链球菌、魏氏梭菌、屎肠球菌、粪肠球菌7种病原菌基因组DNA。以鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌基因组DNA混合物为阳性对照，以生理盐水为阴性对照，分别以3种致病菌及上述7种病原菌单一基因组DNA、10种病原菌基因组DNA混合物为模板，按最佳优化条件进行特异性检测。

1)预制式智能控制柜至预制舱式二次组合设备及预制式组合二次设备的光缆连接，包括各智能终端、合并单元至保护装置和对时装置的光缆均采用预制光缆。

1.2.7 多重PCR体系的敏感性检测 经Nanodrop 2000测定DNA浓度后，用ddH2O分别将鸭疫里默氏杆菌Ra50、大肠杆菌ATCC 25922和沙门氏菌ATCC 13076基因组DNA稀释至1×103pg/μL，在此基础上10倍梯度稀释7个梯度，至1×10-4pg/μL，以系列稀释后的DNA为模板，按最佳优化条件进行敏感性检测。

将鸭疫里默氏杆菌Ra50、大肠杆菌ATCC 25922和沙门氏菌ATCC 13076菌落计数后调整至1×108cfu/mL，用无菌生理盐水10倍梯度稀释，同一稀释度的3种菌各取1 mL混合，水煮法提取总DNA，按最佳优化条件进行敏感性检测。

1.2.8 多重PCR检测体系的临床应用

（1）临床鸭场分离获得的3种病原菌的吻合性检测：2019年从山东省曹县、单县等地养鸭场的病鸭器官组织中分离得到48株鸭疫里默氏杆菌、55株大肠杆菌和48株沙门氏菌，分别经16S rDNA测序鉴定并保存。用最佳优化条件下的多重PCR体系对3种病原菌进行吻合性检测。

（2）临床攻毒鸡病料组织中病原菌的检测：3日龄SPF雏鸡随机分为2组，每组40只，试验组口服沙门氏菌ATCC 13076菌液，每只鸡100μL（109cfu/mL），对照组口服等量无菌PBS缓冲液，隔离器内分别饲养至40日龄。试验组随机选择10只存活的雏鸡，经颈动脉放血处死，每只各取肝脏0.3 g，对照组随机取1只鸡的肝脏组织0.3 g，分别加1 mL PBS缓冲液，研磨取上清，按组织基因组DNA提取试剂盒（杭州博日科技股份有限公司）说明书提取总DNA。以沙门氏菌ATCC 13076的基因组DNA为阳性对照，用最佳优化条件的多重PCR体系进行检测。

2 结果与分析

2.1 3对引物的PCR反应验证

本试验选择的鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌保守基因的引物均能扩增出清晰明亮且符合预期大小的目的条带，其中大肠杆菌phoA基因片段622 bp，鸭疫里默氏杆菌ompA基因片段592 bp，沙门氏菌fimW基因片段495 bp（图1）。

图1 3对引物的PCR扩增结果

2.2 多重PCR反应体系引物浓度优化

对3对引物按照5种不同终浓度配比进行多重PCR反应，结果（图2）显示，ompA、phoA、fimW3个引物对终浓度分别为0.60、0.28、0.20μmol/L时扩增效果最佳。优化后的PCR反应体系为：ompA、phoA、fimW 3个引物对（上、下游引物浓度均为10μmol/L）分别为1.5、0.7、0.5μL，10×reaction buffer 2.5μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2.0 μL，rTaq（5U/μL）0.2μL，3种细菌DNA模板（50 ng/μL）各1μL，ddH2O 14.6μL。

图2 不同引物浓度下多重PCR扩增结果

2.3 多重PCR反应体系最佳退火温度筛选

图3 不同退火温度下多重PCR扩增结果

2.4 多重PCR反应特异性检测

多重PCR扩增结果（图4）显示，只有鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌基因组单一和混合DNA模板、3种致病菌的DNA混合物及包含这3种致病菌的10种菌的DNA混合物可以扩增出对应大小的特异目的条带，其他7种病原菌单一DNA模板和阴性对照均未扩增出目的条带，说明多重PCR检测体系特异性良好。

图4 多重PCR方法特异性检测结果

2.5 多重PCR反应敏感性检测

在DNA水平，多重PCR方法的最低检测限为1 pg/μL（图5A）。在菌水平上，多重PCR方法的最低检测限为1×104cfu/mL（图5B）。

图5 多重PCR方法敏感性试验结果

2.6 多重PCR反应的临床应用

利用优化的多重PCR反应体系对2019年从山东省曹县、单县等地分离鉴定获得的48株鸭疫里默氏杆菌、55株大肠杆菌和48株沙门氏菌进行吻合度检测，结果与16S rDNA测序鉴定结果完全吻合，无漏检、错检情况，说明多重PCR体系应用于3种病原菌检测的准确性和特异性好。

用肠炎沙门氏菌对SPF雏鸡进行攻毒感染，并用优化后的多重PCR体系进行检测，结果（图6）表明，试验组的10只鸡都能检测到与阳性对照一致的沙门氏菌的特异性目的条带，特异性达100%，说明多重PCR体系能够实现从临床病料中直接检测病原菌的感染。

图6 临床分离株多重PCR检测结果

3 讨论与结论

由于禽类感染鸭疫里默氏杆菌的临床症状与其他革兰氏阴性致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等的临床症状非常类似，因此仅凭临床的病理特征难以准确诊断。传统的分离培养鉴定和免疫学检测方法费时费力，灵敏度较低，如胶体金法在鸭疫里默氏杆菌检测中灵敏度仅为106cfu/mL［17］。临床病例中多种细菌混合感染的现象非常严重，分子检测方法如单一PCR，能达到较高的灵敏度，但一次只能检测一种病原菌，不能尽快对临床中混合感染的情况明确病原。基于此，本试验建立了针对鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的多重PCR检测方法，以实现3种重要病原菌单一或混合感染的快速检测。

在多重PCR检测体系中，基因的选择非常关键。用分子方法诊断鸭疫里默氏杆菌的基因有16SrRNA［13，18］、gyrB［19］、dnaB［20］、GroEL［21］和ompA［11］，其中ompA基因编码的外膜蛋白包含C端保守区，存在于鸭疫里默氏杆菌标准株和所有血清型的参考株中［21-24］，因此最适合用于鸭疫里默氏杆菌的检测。沙门氏菌检测常用的基因有invA［14，18，20，25］、fimY［26］、ssaQ［27］、fimW［28］，其中fimW是Ⅰ型鞭毛负调控蛋白基因，与invA相比，fimW广泛存在于各种不同血清型的沙门氏菌中，在Salmonella enterica中的同源性超过98%［28］，漏检或假阳性的概率较低。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因phoA作为大肠杆菌的管家基因，存在于各种大肠杆菌菌株中，适合于大肠杆菌的PCR检测［18，20，29，30］。本试验 分别选择了鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的高度保守基因ompA、fimW和phoA，建立了特异的多重PCR检测方法。

本试验对退火温度、引物浓度等条件进行优化，建立了快速、准确的多重PCR体系，能够同时检测鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌3种致病菌，与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等7种其他常见病原菌无交叉反应，具有很好的特异性。在敏感性检测中，细菌水平上最低检出限为1×104cfu/mL，DNA水平上最低检出限为1 pg/μL。Wei［18］、Hu［20］等建立的多重PCR方法，选择了invA检测沙门氏菌，灵敏度分别为104cfu/mL和10 pg/μL。本检测方法在菌水平上的灵敏度与他们的达到同一数量级水平，但在DNA水平上比Wei等［18］的方法提高了10倍，且检测宿主从单一的鸭扩展到了鸡、鹅、火鸡等不同的禽类，进一步提高了现有的检测水平和能力。

本研究建立的多重PCR检测体系操作简单、快速，高效且成本较低，具有良好的特异性和较高的敏感性，适用于禽类3种常见重要致病菌单一或混合感染的临床和实验室快速诊断、流行病学调查以及对应治疗药物的快速筛选等，为疾病的快速预警和防控提供了重要的参考依据。