粗穗披碱草1HtS染色体臂特异标记开发

王晖，郭军，周宝元，汪晓璐，韩冉，徐文竞，刘爱峰，李豪圣，刘成，刘建军

（1.山东省农业科学院作物研究所／农业部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室／小麦玉米国家工程实验室，山东 济南 250100；2.中国农业科学院作物科学研究所／农业部作物生理生态与栽培重点开放实验室，北京 100081）

小麦（Triticum aestivum L.）是世界上的主要粮食作物之一，其生产水平直接影响着国家粮食安全。我国小麦条锈病和叶锈病发病面积大，常常造成小麦严重减产甚至绝收。近年来由于全球气候变暖，小麦锈病在我国有加重趋势［1］，因此培育和推广抗病小麦品种成为最经济有效且绿色环保的防控措施。长期以来，科学家们一直致力于抗病资源发掘和优异抗病育种材料创制等研究，也获得了一批优异抗病资源［2，3］。然而由于致病生理小种的变异导致获得抗病资源的抗性逐渐丧失［4，5］。小麦近缘植物中含有丰富的抗病、抗逆和抗虫等基因，是小麦育种的优异基因源。通过远缘杂交可以将近缘植物的优异基因转移给小麦，创制小麦-近缘植物异染色体系。这些含小麦近缘植物血缘的异染色体系是拓宽小麦遗传基础、抵御小麦重要病虫害、增加小麦产量和提升小麦品质的重要物质基础［6］。

粗穗披碱草（Elymus trachycaulus，2n＝4x＝28，基因组为StStHtHt）是披碱草属一个具有优异抗性的物种，高抗大麦黄矮病［7］、小麦白粉病［8］、叶锈病［9，10］和秆锈病［11］。Sharma和Gill于1983年开展了粗穗披碱草种质导入小麦研究，通过胚拯救获得了一批小麦-粗穗披碱草远缘杂交材料［12］。1988—1996年 间，Gill［13］、Morris［7］和Jiang［14］等分别从这些杂交后代材料中筛选并鉴定出了小麦-粗穗披碱草附加系、代换系、易位系和端体系等材料。2005年，Friebe等［8］对小麦-粗穗披碱草罗伯逊易位系1HtS·1BL进行研究，命名了抗叶锈基因Lr55。2013年，刘成［15］和宫文萍［11］等的研究发现，该易位系不仅同时近免疫美国和中国的叶锈菌小种，还近免疫我国西南麦区流行的条锈菌混合小种。因此，该易位系是不可多得的兼抗型材料。

内含子是真核生物基因在转录形成成熟RNA过程中，由蛋白质-RNA复合体识别并剪切掉的非编码基因组序列，其内部存在各种各样潜在内含子多态性（potential intron polymorphism，PIP）。Yang等［16］在大麦、高粱、大豆和棉花等59个物种中开发了57 658个PIP标记，并建立了PIP标 记 数 据 库 （http://ibi.zju.edu.cn／pgl／pip／）。在有差异的内含子两侧的外显子序列上设计引物，利用PCR扩增出内含子序列的片段进行多态性检测，称为内含子长度多态性（intron length polymorphism，ILP）［17］。ILP标记具有基因特异性、共显性、高变且遗传稳定、丰度高等特点，可用于分子辅助育种。研究表明，外显子-内含子结构在不同物种的同源基因中基本上是保守的［18］。因此，这使得在没有参考基因组的物种中开发ILP标记成为可能。截至目前，粗穗披碱草中尚未有ILP标记的相关报道。基于此，本研究以小麦-粗穗披碱草1HtS·1BL易位系与中国春ph1b基因缺失突变体杂交回交后代等材料进行分子标记筛选和验证，开发了粗穗披碱草1HtS特异的ILP标记。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料列于表1。其中，序号1～21的材料由美国堪萨斯州立大学Friebe教授提供；绵阳11和安岳排灯麦由电子科技大学杨足君教授提供；光头小麦由四川农业大学王益教授提供；TA5072／CS ph1b BC1F2材料为中国春-粗穗披碱草1HtS·1BL罗伯逊易位系TA5072（以下简称1HtS·1BL易位系）与中国春ph1b基因缺失突变体的BC1F1后代材料。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组总DNA提取 供试材料基因组总DNA用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取。取叶片约100 mg放入2 mL离心管（提前加入直径2 mm的钢珠）中，液氮中速冻，然后用SCIENTZ-192组织研磨机在30 Hz频率下将叶片打碎至粉末，加入缓冲液FP1 400μL和Tnase 6μL，涡旋振荡1 min，室温放置10 min；然后加入缓冲液FP2 130 μL，轻轻混匀，涡旋振荡1 min，12 000 r／min离心5 min，将上清转移至新的离心管中；向上清液中加入70%体积的异丙醇，充分混匀，12 000 r／min离心2 min，弃上清，保留沉淀；加入70%的乙醇500μL洗涤DNA，12 000 r／min离心2 min，弃上清，再次用70%的乙醇500μL洗涤一次，步骤与第一次的相同。晾干后，加入ddH2O把DNA溶解成100μL原液，检测提取DNA的纯度和浓度，并用ddH2O将DNA原液稀释到25 ng／μL，作为进行PCR的模板DNA。

1.2.2 染色体第一同源群基因序列生物信息学分析及引物设计 下载中国春参考基因组（https://urgi.versailles.inra.fr／download／iwgsc／IWGSC＿RefSeq＿Assemblies／v1.0／）的1A、1B和1D基因组序列信息和基因注释，检索出内含子及其所在基因的位置和长度，选择A、B和D高度同源的基因序列且序列长度小于1 000 bp的内含子用于标记开发。根据检索到的参考基因，提取内含子上、下游各100 bp的DNA序列，合成200 bp的查询序列。将查询序列到NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov／）数据库进行比对，分析不同小麦同一内含子的长度多态性。最后，利用Premier 5.0软件对查询序列进行批量设计引物，使上、下游引物分别落在查询序列的前、后半段，要求引物长度在18～24 bp之间，预计退火温度Tm值在52～60℃之间，且上游和下游引物的Tm值相差在5℃以内。引物GC含量40%～60%，且尽量避免引物二级结构Dimer、Hairpin、Falseprimer以及6个碱基配对的出现。利用小麦族多组学数据网 站 （http://202.194.139.32／blast／viroblast.php）的Blast功能，确定ILP引物的染色体位置。设计的引物由青岛擎科天成生物技术有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增 根据引物合成推荐的退火温度进行PCR扩增。30μL PCR反应体系为：25 ng／μL的模板DNA 2.0μL，5 U／μL DNA Taq聚合酶0.3μL，200μmol／L的dNTPs 2.0μL，含Mg2＋的10×PCR缓冲液3.0μL，10μmol／L的上、下游引物各2μL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至30μL。PCR反应扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。

1.2.4 PCR产物电泳及检测 PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）电泳检测。PAGE胶每100 mL的配置包括30%丙烯酰胺溶液（acrylamide-bisacrylamide，Acr-Bis，29∶1）20 mL，5×TBE缓冲液20 mL，10%过硫酸铵溶液（ammonium persulphate，AP）1 mL，四甲基乙二胺（N，N，N′，N′-tetramethylethylenediamine，TEMED）40μL，最后用无菌双蒸馏水补充至100 mL。电泳完后，PAGE胶在1μg／mL的溴化乙锭溶液中染色30 min，最后在GDS-Gel Dol 2000紫外凝胶成像系统下扫描照相。

2 结果与分析

2.1 引物的PCR筛选

根据中国春小麦染色体1A、1B和1D的内含子序列设计合成了41对ILP引物。以中国春-粗穗披碱草1Ht附加系和中国春为材料，对合成的这41对ILP引物进行PCR扩增筛选，结果显示，ILP 2、ILP 8和ILP 10等18对引物可以在供试材料中扩增出1～2条多态性条带（表2），引物ILP 5和ILP 21在供试材料中扩增不出条带或条带非常微弱，ILP 1、ILP 3和ILP 4等21对引物在供试材料中没有扩增出多态性条带。其中，引物ILP 1—ILP 22的扩增结果如图1所示。

2.2 多态性DNA带特异性验证

为了验证ILP 2、ILP 8和ILP 10等18对ILP引物扩增出多态性条带的特异性，用这18对引物对粗穗披碱草、中国春-粗穗披碱草1Ht附加系、中国春、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、安岳排灯麦和光头小麦进行扩增。结果发现，粗穗披碱草和中国春-粗穗披碱草1Ht附加系能扩增出对应长度的多态性条带，而所有对照小麦均扩增不出这些条带，因此，这些多态性条带可能是粗穗披碱草1Ht染色体特异标记，即表明这18对引物可能可用于追踪小麦背景中的1Ht染色体。这18对引物的序列、所在小麦染色体的物理位置、设计引物参考的基因及能扩增出多态性片段长度等信息如表2所示。

表2 在中国春-粗穗披碱草1Ht附加系中扩增出特异条带的18对ILP引物

图1 引物ILP 1—ILP 22在中国春-粗穗披碱草1Ht附加系和中国春中的扩增结果

2.3 多态性DNA带染色体定位及应用

为了验证ILP 2、ILP 8和ILP 10等18对ILP引物扩增出的特异条带是否仅存在于粗穗披碱草1Ht染色体上，以中国春为对照，用这18对引物对中国春-粗穗披碱草1Ht附加系、1St附加系和1HtS·1BL易位系等17份小麦-粗穗披碱草染色体系（表1中序号3～19的材料）进行扩增，结果发现，含粗穗披碱草1HtS染色体的中国春-粗穗披碱草1Ht附加系、1HtS·1BL易位系和1HtS端体附加系均能扩增出上述多态性条带，而其余14份小麦-粗穗披碱草染色体系（表1中序号6～19的材料）扩增不出这些多态性条带，因此，这些多态性DNA带是粗穗披碱草1HtS染色体特异分子标记。

为了验证粗穗披碱草1HtS染色体特异分子标记对群体检测的可用性，用这18对引物分别对中国春-粗穗披碱草1HtS·1BL易位系／CS ph1b BC1F2群体材料L1—L151进行扩增。结果发现，这18对引物均能在部分群体材料（87～103个单株不等）中扩增出目标多态性条带，因此，这些多态性DNA带可以作为检测涉及粗穗披碱草1HtS的小麦-粗穗披碱草杂交种质的分子标记。其中，引物ILP 17对L1—L151中部分材料的扩增情况如图2所示。

图2 引物ILP 17在杂交分离群体材料中的扩增结果

3 讨论与结论

3.1 物种染色体特异标记建立方法

物种特异标记的开发对辅助作物遗传改良具有重要意义［19］。在小麦及小麦远缘杂交研究中，使用比较广泛的分子标记是SSR和SNP标记。其中，SSR标记已经被广泛应用于品种一致性鉴定或基因粗定位等研究［20，21］；功能型SNP标记是由与表型变异相关基因衍生的标记，具有弥补结构多态性和功能多样性之间差距的最大潜力，在物种遗传多样性［22］、基因精细定位和克隆［23］及小麦远缘杂交种质资源鉴定等［24］方面应用潜力巨大。粗穗披碱草是小麦的优异基因源，因为没有参考基因组，开发的分子标记比较有限［11，13，25］。内含子标记在水稻和小麦［26］、簇毛麦［27］等物种中已经被广泛开发和运用，而在粗穗披碱草中全基因组开发和应用尚未有报道。基于此，我们开展了该项研究，建立了粗穗披碱草1HtS染色体臂特异标记18个，为小麦背景中1HtS染色质检测提供了新方法。本研究分析小麦基因序列开发标记设置参数为内含子长度低于1 000 bp，然而实际开发出部分粗穗披碱草1HtS特异标记的长度超过1 000 bp，这表明粗穗披碱草部分基因内含子长度大于小麦，这也暗示，可能可用类似方法开发小麦族中其他小麦近缘物种染色体特异标记。

3.2 粗穗披碱草染色体特异标记开发效率

在粗穗披碱草染色体特异标记开发方面，Morris和Gill［28］建立了粗穗披碱草染色体标准C带和N带；Jiang等［14］开发了可用于检测粗穗披碱草St基因组的特异探针；宫文萍等［29］建立了可追踪小麦背景中粗穗披碱草1St、5Ht、6Ht和7Ht的寡聚核苷酸荧光原位杂交（FISH）标记。然而，由于C带、N带或FISH等细胞学试验，或操作步骤繁琐或需要特殊仪器，并不是所有实验室都能开展。分子标记具有表现稳定、操作简单、不受组织器官或发育时期特异性影响等优点，被科学家们广泛应用。Gill等［13］建立了粗穗披碱草染色体特异RFLP标记，然而该标记的建立涉及放射性同位素，已不常用。宫文萍等［11］建立了粗穗披碱草1Ht染色体特异CAPS标记，标记开发效率为1.15%（1／87）。韩冉等［25］建立了粗穗披碱草1Yc染色体特异PLUG标记，标记开发效率为5.66%（3／53）。本研究通过生物信息学开发基于内含子扩增多态性的方法，建立了粗穗披碱草1HtS染色体特异标记20个，标记开发效率为43.90%（18／41），远高于基于EST-STS开发CAPS标记［11］和开发PLUG标记［25］等方法的效率。

3.3 物种染色体特异标记的用途

Ishikawa等［26］建立了水稻单拷贝基因PLUG标记，利用小麦缺体-四体为工具，将这些标记锚定到小麦1条或多条染色体上。陈仕勇等［30］建立了10个四倍体披碱草属物种核型。陈智华等［31］建立了野生垂穗披碱草SRAP标记。苗佳敏等［32］建立了垂穗披碱草SRAP和RAPD标记。上述研究建立的物种标记仅能鉴定小麦或小麦近缘物种染色体，但不能应用于小麦背景中近缘物种染色体鉴定。在检测小麦背景中粗穗披碱草染色体标记方面，虽然基于EST-STS的CAPS标记［11］和PLUG标记［25］已经被建立起来，但建立的标记数量太有限，远不能满足对含1HtS不同片段长度的小麦-粗穗披碱草易位染色体进行鉴定。本研究建立了粗穗披碱草1HtS特异标记18个，极大地丰富和加密了1HtS染色体分子标记密度。利用这18个标记鉴定151份群体材料，发现不同标记鉴定出含粗穗披碱草1HtS染色质的单株数为87～103不等，表明这些后代材料中粗穗披碱草染色体易位断点位置不同，因而，这些标记可以用于小麦-粗穗披碱草染色体易位系易位断点判定。