小麦-智利大麦染色体端体系的鉴定

陈志伟，宫文萍，韩冉，李豪圣，刘建军，贾举庆，刘成

（1.山西农业大学农学院，山西 太谷 030801；2.山东省农业科学院作物研究所，山东 济南 250100）

小麦是重要的粮食作物，为全世界人类提供了大约20%的能量［1］。我国的小麦种植面积约是世界小麦种植面积的十分之一，播种面积仅次于玉米和水稻，是我国第三大粮食作物。近年来，我国小麦单产稳步提升、总产持续增长，小麦生产取得了举世瞩目的成就［2］。然而，长期以来育种家们对少数骨干亲本的大量利用及相似品种间的相互杂交，容易造成品种抗源日趋单一化和遗传变异范围缩小等问题［3］，一旦新致病生理小种爆发，将很难应对。因此，通过遗传改良并培育多样性更加丰富的高产抗病品种是解决上述问题的关键。小麦野生近缘种中含有抗病、抗逆和多分蘖等优异性状，是小麦的优异基因源［4］，育种家可以通过小麦远缘杂交和染色体工程培育多样性更加丰富的高产抗病品种。

向小麦引进近缘物种的优异基因通常过程是先将二者杂交，获得小麦-近缘植物双二倍体或部分双二倍体［3，5］；再将双二倍体或部分双二倍体与小麦进行杂交回交，获得小麦-近缘植物附加系或代换系［3，5，6］；然后，再将附加系或代换系与小麦或ph1b基因缺失突变体进行杂交回交，获得易位系或端体系［3，7］。其中，小麦-近缘植物双二倍体、部分双二倍体、附加系和代换系是近缘植物向小麦转移优异基因的桥梁材料，附加系、代换系、易位系和端体系是定位和利用近缘植物优异基因的重要材料［3］。

智利大麦是小麦改良的优异近缘物种，主要分布在智利和阿根廷，基因组为HchHch，高抗叶锈病、白粉病和全蚀病等病害［8，9］，同时具有耐干旱［10］和耐盐［10，11］等特点。目前，已有小麦-智利大麦双二倍体和附加系创制的报道［3，8，12，13］，但有关端体系的报道非常少见。鉴于此，本研究利用荧光原位杂交和分子标记等方法对小麦-智利大麦1Hch＋1HchS附加系自交后代进行筛选，鉴定出小麦-智利大麦1HchS单端体系和1HchL双端体系，为将源自智利大麦1Hch染色体的耐盐和抗禾谷孢囊线虫基因［8］定位到染色体臂上提供了重要材料，并获得了可以追踪小麦背景中智利大麦1Hch染色体的特异分子标记。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小麦中国春（Chinese Spring，CS）由电子科技大学杨足君教授提供。济麦22（JM22）和济麦23（JM23）由山东省农业科学院作物研究所小麦遗传育种团队培育。中国春-智利大麦双二倍体（CS-Hchamp）和中国春-智利大麦1Hch＋1HchS附加系（Heter CS-Hchadd）由英国约翰英纳斯中心（John Innes Centre，JIC）的Reader S M教授提供。中国春-智利大麦4Hch附加系（TA7588）、5Hch附加系（TA7589）、6Hch附加系（TA7590）以及7Hch附加系（TA7591）由美国堪萨斯州立大学小麦遗传与基因资源中心（Wheat Genetic and Genomic Resources Center，WGGRC）的Gill B S提供。ZLDM1—ZLDM50为小麦-智利大麦1Hch＋1HchS附加系自交F2后代材料。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 供试材料基因组总DNA用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取。取约100 mg的叶片放入2 mL离心管（提前加入直径2 mm的钢珠）中，液氮中速冻，然后用SCIENTZ-192组织研磨机在30 Hz频率下将叶片打碎至粉末，提取方法参照文献［14］。

1.2.2 IT引物与PLUG引物的PCR扩增及电泳 IT引物序列及PCR扩增程序参照文献［15］，PLUG引物序列及PCR扩增程序参照文献［16］。染色体第一同源群的135对IT引物和26对PLUG引物由青岛擎科天成生物技术有限公司合成。IT-PCR和PLUG-PCR产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，电泳后凝胶在紫外凝胶成像仪GDS-Gel Dol 2000下扫描照相。

1.2.3 染色体制片与荧光原位杂交 试验材料的根尖处理和染色体制片方法，以OligopSc119.2-1和Oligo-pTa535-1为探针进行的原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）所用探针合成、探针浓度、具体操作步骤，以及原位杂交染色体制片自然干燥后的具体操作步骤等参见文献［8］。

2 结果与分析

2.1 小麦-智利大麦染色体端体系的筛选与鉴定

以Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1为探针的FISH可以鉴定出小麦背景中的智利大麦1Hch染色体，且其染色体长臂和短臂信号不同［8］。本研究以上述两探针的FISH对小麦-智利大麦1Hch＋1HchS附加系自交F2后代材料ZLDM1—ZLDM50进行筛选与鉴定，结果发现，50个单株中，20个单株含整条1Hch染色体，12个单株含1HchS和1HchL端体，13个单株无外缘染色体，ZLDM7和ZLDM43含1条1HchL染色体，ZLDM29含1对1HchL染 色 体，ZLDM14和ZLDM37含1条1HchS染色体。对ZLDM29和ZLDM37进行染色体计数发现，二者的染色体条数分别为42＋2t（t＝telosomics）和42＋t，外缘染色体臂杂交信号与文献相同，因此，ZLDM29和ZLDM37分别是小麦-智利大麦1HchL双端体系（图1A）和1HchS单端体系（图1B）。

图1 寡聚核苷酸探针Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1对供试材料的鉴定结果

2.2 染色体第一同源群IT引物与PLUG引物筛选

以中国春和中国春-智利大麦双二倍体为材料，筛选合成的染色体第一同源群IT引物和PLUG引物，结果发现，超过95%的引物均能在供试材料中扩增出明显的2～3条DNA条带。相比中国春，PLUG引物中的TNAC1530、TNAC1535和TNAC1536可以在中国春-智利大麦双二倍体中扩增出额外的多态性条带（图2A）；IT引物中的CINAU1185、CINAU1186和CINAU1187可以在中国春-智利大麦双二倍体中扩增出额外的多态性条带（图2B）。上述条带可能可作为分子标记用于检测小麦背景中智利大麦染色质。

图2 IT引物和PLUG引物在中国春和中国春-智利大麦双二倍体中的扩增结果

2.3 智利大麦基因组多态性DNA片段的染色体定位

为了验证上述IT引物和PLUG引物扩增出多态性条带在检测小麦背景中智利大麦染色质的可行性及确定它们在智利大麦染色体上的定位，用引 物TNAC1530、TNAC1535、TNAC1536、CINAU1185、CINAU1186和CINAU1187对中国春-智利大麦1Hch＋1HchS附加系、1HchL单端体系、1HchL双端体系、1HchS＋1HchL端体系、1HchS单端体系、4Hch附加系、5Hch附加系、6Hch附加系、7Hch附加系、1Hch＋1HchS附加系自交F2后代材料ZLDM1—ZLDM50以及济麦22和济麦23进行扩增，结果发现，仅引物CINAU1186和TNAC1536可以在含1HchL的材料中扩增出长度分别为350 bp和700 bp的特异多态性条带（图3），而在其他材料中扩增不出这些多态性条带（除TNAC1536能在6Hch附加系中扩增出多态性条带），因此，这些多态性条带可以作为分子标记检测小麦背景中的1HchL染色质。引物TNAC1530、TNAC1535、CINAU1185和CINAU1187未能像预期一样在除中国春-智利大麦双二倍体外的供试材料中扩增出目标多态性带，表明这些多态性条带可能在中国春-智利大麦双二倍体与小麦杂交回交过程中丢失或对应基因序列发生了变异。引物CINAU1186和TNAC1536的序列信息如表1所示。

图3 引物CINAU1186和TNAC1536在部分供试材料中的扩增结果

表1 获得智利大麦染色体特异分子标记对应的引物信息

3 讨论与结论

在小麦-智利大麦染色体系创制方面，Miller等［17］最早在1981年开展了将智利大麦染色质转移给小麦的研究，获得了小麦-智利大麦双二倍体以及4Hch—7Hch附加系等种质。Antonio Fernández［18］、Padilla［19］等也先后在1985年 和1987年开展了四倍体小麦和智利大麦杂交工作并获得了染色体双二倍体。1990年，我国学者蒋继明和刘大均也通过离体幼胚培养和回交等方法获得了小麦-智利大麦BC1F1材料［20］。Del Carmen等［21］在2012年将智利大麦4Hch染色体导入硬粒小麦，获得了硬粒小麦-智利大麦4Hch代换系和附加系。Mattera等［13］在2015年创制出了小麦-智利大麦7Hch染色体渐渗系。Mattera和Cabrera于2017年将中国春-圆柱山羊草2C染色体附加系与小麦-智利大麦7Hch（7D）附加系进行杂交，获得了3个纯合的小麦-智利大麦罗伯逊易位系［22］。2019年，Palomino和Cabrera又创制出了小麦-智利大麦2Hch染色体渐渗系［23］。上述研究中未发现涉及小麦-智利大麦1Hch端体系创制的报道，因为1Hch上含有耐盐和抗禾谷孢囊线虫等重要基因，因此，创制涉及智利大麦1Hch的染色体端体系对定位和利用相关基因具有重要价值。鉴于此，本研究从小麦-智利大麦1Hch＋1HchS附加系自交后代中鉴定出了小麦-智利大麦1HchS端体系和1HchL端体系，为智利大麦优异基因定位提供了工具材料。

在智利大麦染色体特异标记建立方面，Miller等［17］利用形态学标记和生化标记等对智利大麦染色体同源群归属进行了鉴定。Hueros等［24］从智利大麦中发掘出特异重复序列作为探针用于有效区分小麦和智利大麦染色体。Hernáhndez等［25］利用RAPD引物对小麦-智利大麦附加系等材料进行扩增，获得智利大麦特异RAPD片段进行克隆测序并将其转化成了STS标记。Castillo等［26］利用EST-SSR引物对不同的智利大麦和小麦-大麦附加系进行扩增，建立了智利大麦EST-SSR标记。Said和Cabrera［27］设计了大麦染色体4H特异引物对智利大麦和小麦进行扩增，建立了智利大麦4Hch染色体特异SSR标记、EST-SSR标记和STS标记。Mattera等［13］利用染色体第7同源群上的EST和COS引物对智利大麦和小麦等材料进行扩增，建立了智利大麦染色体第4Hch染色体特异分子标记。Mattera和Cabrera［22］以智利大麦7Hch上八氢番茄红素合成酶（Psy1）基因序列为基础开发了该基因标记用于对小麦-智利大麦杂交后代进行鉴定。上述研究未见智利大麦1Hch染色体特异分子标记建立的报道。鉴于此，本研究以源自簇毛麦的IT引物和源自水稻的PLUG引物对从小麦、小麦-智利大麦染色体系、小麦-智利大麦杂交分离群体等进行扩增，建立了智利大麦1HchL染色体臂特异分子标记，为小麦背景中1HchL染色体臂追踪提供了检测方法。然而，本研究未在小麦和小麦-智利大麦1HchS端体系间发现多态性，需今后重点开发该染色体臂特异分子标记。