番茄环纹斑点病毒的研究进展

刘宇艳，张洁，陈勇，魏辉

（1.福建省农业科学院植物保护研究所／福建省作物有害生物监测与治理重点实验室／农业部福州作物有害生物科学观测试验站／福建省作物有害生物绿色防控工程研究中心，福建 福州 350003；2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所／云南省农业生物技术重点实验室／农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室，云南 昆明 650223）

2005年，中国云南省的番茄（Lycopersicum esculentum）和辣椒（Capsicum annuum）产区爆发了一种新型植物病毒病害，感病的番茄和辣椒果实表面均分布有同心圆状的斑纹，叶片出现坏死斑，植株褪绿、矮化或无花［1］。Dong等［1］从采集的发病样品中分离出一种新型正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）病毒，并将其命名为番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV）。目前，该病害主要在我国云南、广西的番茄、辣椒和烟草产区发生，由介体蓟马以持久增殖型方式传播，给我国农业生产造成巨大损失。本文对该病毒的生物学特性、地理分布、寄主范围、危害症状、传播途径和检测技术等进行归纳总结，旨在为今后TZSV的研究和防控提供参考。

1 番茄环纹斑点病毒及其传播介体

1.1 生物学特性

番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV）属布尼亚病毒科（Bunyaviridae）正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）西瓜银斑病毒（Watermelon silver mottle virus，WSMoV）血 清 组［1，2］。TZSV是一种RNA病毒，其三个基因组片段从大到小依次为ssRNA－L（负义）、ssRNA－M（双义）和ssRNA－S（双义），共编码4个结构蛋白与2个非结构蛋白。其中，ssRNA－L全长共8 919个碱基，含有1个开放阅读框（open reading frame，ORF），其互补链编码一个大小约为332.7 kDa的依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNApolymerase，RdRp）。ssRNA－M由4 945个碱基组成，包含两个ORF，分别编码大小约为34.4 kDa的非结构蛋白NSm（non-structural protein m）以及大小约为127.4 kDa的糖蛋白Gn／Gc前体蛋白（precursor to the Gn and Gc glycoproteins）［3－5］。ssRNA－S最短，共3 279个碱基，也包含两个ORF，分别编码大小约为51.9 kDa的非结构蛋白NSs（non-structural proteins）和大小约为30.6 kDa的核衣壳蛋白N（nucleocapsid protein N）。

1.2 地理分布、寄主与发病症状

2005年，TZSV首次发现于中国云南省的番茄和辣椒产区［1］，随后在广西等地的多种作物上均有发生［6，7］。TZSV的潜在寄主包括7科总计约25种植物，如番茄、辣椒、烟草（Nicotiana tabacum）和土豆（Solanum tuberosum）等重要的经济作物［8，9］，以及文殊兰（Crinum asiaticum）、鸢尾（Iris tectorum）等观赏花卉植物［10－13］。TZSV可与其他病毒复合侵染作物，如自然情况下，TZSV常与马铃薯Y病毒（Potato potyvirus Y，PVY）复合侵染烟草和辣椒，通常复合侵染引起的病毒病害比单一病毒侵染造成的危害更严重［14］。

据报道，TZSV引起的病害症状与寄主品种、感染阶段及环境等因素有关。TZSV在番茄的整个生长期均可侵染危害，感病苗龄越小，发病越严重。幼苗受害后一周内即出现顶端坏死，随后迅速枯萎、死亡［15］；较大的番茄植株感染TZSV后新叶迅速出现淡绿色坏死斑，主脉的一侧生长停滞且呈镰刀形，老叶上则出现大量的环状坏死斑痕。感染病毒的幼果表面有轻微凹陷的环斑或坏死小环斑，果实通常畸形且保持绿色；成熟果实则可观察到红白相间或红黄相间的同心圆症状［1，16］。感染TZSV的辣椒叶片上出现较小的褪绿或坏死斑，茎脉、叶柄和茎的内部则会出现坏死性病变，随着茎内坏死病变范围扩大，新叶会出现坏死、脱落，最终导致感病植株死亡；感病果实上也会出现褪绿环斑［1］。感病普通烟的叶片最初出现点状黄斑，随后黄斑扩大且周围逐渐斑枯；后期叶片出现大面积黄化及坏死，叶脉变形、黄化，顶端的新叶皱缩形似镰刀，严重时整个顶部萎蔫坏死［17－19］。鸢尾感病后植株矮化、无花，叶片褪绿泛黄、出现坏死性环斑等症状，严重影响观赏价值与经济价值［11］。

1.3 传播介体

蓟马类昆虫是正番茄斑萎病毒属病毒的主要传播介体［20］。蓟马取食感病植株后获毒，病毒在蓟马体内完成侵染循环，再在取食的过程中将病毒传到健康的寄主植物中。因此，蓟马种群数量决定病害的发生和流行［10］。目前已报道TZSV的介体昆虫包括西花蓟马（Frankliniella occidentalis）、梳 缺 花 蓟 马（F．shculetzi）、棕 榈 蓟 马（Thrips palmi）和烟蓟马（T．tabaci）［1，15，21，22］。西花蓟马作为云南省多个地区的优势种群，是TZSV最为重要的传播介体［23，24］。

1.4 病毒—寄主植物—介体昆虫三者互作

转录组测序结果表明，TZSV感染烟草12天后会引起烟草植株中2 102个基因差异表达，其中1 518个上调表达，584个下调表达；这些基因的差异表达对植物自身的代谢途径、氧化还原反应、光合作用、激素调节水平等生命活动产生影响［18］。目前受关注较多的是TZSV引起的植物激素水平改变对介体蓟马生长发育以及趋性行为等的影响。如Zheng等［21］研究发现，西花蓟马取食感染TZSV的番茄和辣椒叶片可引起若虫发育历期缩短，若虫期和蛹期的存活率显著高于饲养在健康叶片上的蓟马种群，表明感染TZSV的寄主植物有助于提高介体西花蓟马种群适合度。郑雪等［25］通过Y型嗅觉仪测定西花蓟马的趋性行为，结果表明与健康辣椒相比，西花蓟马偏好选择感染TZSV的辣椒植株；进一步研究发现，感病辣椒叶片中多种植物挥发物含量显著增加。此外，TZSV感染寄主辣椒后能显著抑制植株中水杨酸（salicylic acid，SA）含量及其相关基因的表达水平，辣椒叶片中水杨酸含量的降低可促进介体西花蓟马种群的繁衍，从而有利于TZSV传播［26］。Chen等［22］在以TZSV侵染的辣椒为寄主植物的竞争体系中，发现西花蓟马试验种群在更短时间内取代了棕榈蓟马试验种群。西花蓟马除自身具有更强的繁殖力，其对棕榈蓟马生殖干扰也是产生这一现象的重要原因。这些结果表明，TZSV不仅能改变寄主植物挥发物质含量从而吸引介体昆虫取食，也能抑制寄主植物抗性、提高介体蓟马适合度，最终促进病毒的传播。

2 检测技术

分子生物学、血清学、形态学等技术已被应用于TZSV的检测。（1）分子生物学：通过提取植物样品或昆虫样品的总RNA［27，28］，利用PCR对病原物进行检测，该方法简便、灵敏度高、特异性强、结果精准［1，19，24］。徐弢等［29］根据TZSV保守的N基因（GenBank登录号：13YV639）设计特异性引物，通过优化反应条件和反应体系，构建了TZSV的SYBR Green RT－qPCR检测方法，该方法具有灵敏度高、特异性好等优点。（2）血清学：通过制备病毒蛋白的对应抗体，结合酶联免疫吸附测定（ELISA）中的双抗体夹心ELISA（DAS－ELISA）、斑点ELISA（Dot－ELISA，DELISA）或间接ELISA（I－ELISA）等方法可快速、批量检测样品［7，24］。郑宽瑜等［5，17］分别以TZSV的N蛋白与Gn蛋白多克隆抗体为一抗，以胶体金标记羊抗兔IgGgold（10 nm）为二抗，运用免疫胶体金方法对TZSV病毒颗粒进行负染和标记检测。田金艳［30］、Chen［31］、Niu［32］等制备了TZSV－N蛋白的单克隆抗体，并在此基础上研发出可快速检测TZSV的胶体金免疫层析试纸条（colloidal gold immunochromatographic strip，GICA），该产品在5～10 min内即可特异性的识别TZSV，大大提高了检测效率。（3）电镜观察：通过对样品的组织液负染或超薄切片后染色，在电子显微镜下观察病毒形态。TZSV为直径80～120 nm球形封闭的病毒粒子，其在不同的寄主植物或不同植物组织中分布规律存在差异，如在烟草叶片细胞及韧皮部薄壁细胞中多为单个或几个聚集在内质网池中［33，34］；在甜椒组织内主要呈单个粒子分布；在番茄果实中则散布或呈块状、管状，由囊泡包裹着聚集于细胞内［16，34］。

3 防控策略

虫媒病毒病防控应以“预防为主、综合防治”的“防虫治病”原则和“绿色防控”为导向［35］。

预防措施：（1）合理施肥，加强田间管理和改善作物生长环境以增强作物抗病能力；（2）清除种植区及周边蓟马类昆虫的越冬寄主，通过定期喷施农药或释放天敌等措施防治蓟马［36］；（3）定期采样检测，做到尽早发现，及时处理。

防治措施：蓟马的防治手段多样［37－39］，主要有：（1）通过释放天敌控制传毒蓟马。谷培云等［39］通过在西花蓟马和花蓟马危害较为严重的彩椒大棚内释放巴氏钝绥螨（Amblyseius barkeri）和剑毛帕厉螨（Stratiolaelaps scimitus）可有效控制蓟马种群数量；东亚小花蝽（Orius sauteri）是多种农业害虫的天敌，其成虫、若虫均能捕食蓟马，对辣椒、茄子田里的西花蓟马种群具有较强的控制效果，在作物苗期释放东亚小花蝽是生物防治蓟马的有效手段［40，41］。（2）利用微生物防控传毒蓟马。近年来，一些高毒力虫生真菌如球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）等已广泛应用到西花蓟马的生物防治中［42］。（3）利用植物源挥发物或者蓟马信息素，结合蓟马对光波的趋性特点诱杀传毒蓟马。西花蓟马和烟蓟马对反射波长为430 nm的蓝紫光、450 nm的蓝色光和562 nm的黄光有较强的趋性，研究表明此类颜色诱虫板能较好地诱杀蓟马类害虫［43，44］。此外，研究表明р－茴香醛（p-methoxybezaldehyde）、香叶醇［（2E）-3，7－dimethyl-2，6-octadien-1-ol］、芳樟醇（3，7-dimethylocta-1，6-dien-3-ol）和异烟酸乙酯（ethyl isonicotinate-4-carboxylate）等植物源挥发性物质对蓟马具有诱集作用，并已广泛应用于田间蓟马类害虫的诱杀［45］。（4）利用低毒高效杀虫剂防控传毒蓟马。Zheng等［21］研究发现质量浓度为0.25 g／L螺虫乙酯（spirotetramat）对西花蓟马具有较好的致死作用。吡虫啉与高效氯氟氰菊酯（lambda-cyhalothri）按照7∶3比例复配，对西花蓟马的共毒系数为194.82，具有显著的杀虫效果［46］。（5）合理利用抗性资源防控TZSV。庞洪翠［47］研究发现宁夏广泛种植的‘74－82’和‘娇龙’辣椒品种属于西花蓟马高抗品种，西花蓟马在这两种辣椒品种上种群适合度较低。

4 展望

持久增殖型病毒在介体昆虫取食感病的植株时病毒粒子通过口针进入昆虫消化道，随后病毒在突破昆虫体内多重组织屏障和免疫屏障后进入唾液腔，当昆虫再次刺吸植物时，病毒随着昆虫的唾液进入寄主植物组织细胞中，实现病毒在寄主植物间的传播［48］。因此，揭示介体传播病毒的过程对于制定合理的病害防控策略具有重要意义。目前已有的相关研究主要涉及病毒在寄主植物细胞中的形态及蛋白功能等［3，34］，TZSV在介体蓟马体内的侵入、复制、扩散等机制研究尚待开展。

虽然WSMoV与TZSV氨基酸序列一致性较高，但关于WSMoV的研究较少［49］。近年来，番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的代表种番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）的研究较为深入［50－52］，但研究表明TZSV与TSWV各个蛋白在寄主体内的形态及分布模式差异较多。如尚卫娜［3］利用激光共聚焦显微镜观察TSWV和TZSV运动蛋白NSm在烟草表皮细胞和粉蚊夜蛾（Trichoplusia ni）培养细胞Tn中的定位情况，明确了TSWV－NSm可形成小管并延伸至邻近细胞，而TZSV－NSm则主要以网状形式聚集于细胞质内，未形成小管；尚卫娜［3］、Zhang［34］等通过透射电镜观察到TSWV常以多个粒子聚集的方式包裹在囊泡里，但TZSV常以单个或少数几个粒子的方式聚集。因此，TZSV与TSWV各个蛋白在寄主体内的功能可能存在差异。目前，仅赵星月等［53］从西花蓟马cDNA文库中初步筛选到一个与NSs互作的介体蛋白——类电压依赖性阴离子通道（voltage-dependent anion-selective channellike，VDAC），但VDAC与NSs互作机制及其功能尚不清楚。由此可见，TZSV与介体昆虫互作亟需通过试验验证。

郑雪等［25］研究表明，TZSV侵染过的辣椒对西花蓟马有显著的诱集作用，但其机理尚待研究。因此，鉴定西花蓟马定位感病辣椒关键气味受体或气味结合蛋白基因，筛选西花蓟马识别感病辣椒的特异性挥发物，可为开展通过调控介体昆虫行为来控制病毒病提供理论支持。