HPLC-MS/MS法测定设施甜樱桃果实中的赤霉素含量

张倩，杜海云，贾厚振，王明林，辛力

(1. 山东省果树研究所，山东 泰安 271000；2. 山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271000；3.泰安市食品药品检验检测中心，山东 泰安 271000)

HPLC-MS/MS法测定设施甜樱桃果实中的赤霉素含量

张倩1，2，杜海云3，贾厚振1，王明林2，辛力1

(1. 山东省果树研究所，山东 泰安 271000；2. 山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271000；3.泰安市食品药品检验检测中心，山东 泰安 271000)

为了测定设施甜樱桃果实中的赤霉素含量，建立了甜樱桃果实中赤霉酸的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)定性定量检测方法。样品经乙腈提取，液-液分配法进行净化，在SIM模式下对目标物质进行定性和定量检测，同时对设施甜樱桃激素坐果果实中赤霉酸含量进行测定。结果表明，赤霉酸的定量限为4.03 μg·kg-1，在5.0～100.0 μg·L-1范围内呈现良好的线性关系，相关系数R为0.9996。方法的加标回收率为87.64%～91.75%，相对标准偏差为8.9%～13.5%，5份设施甜樱桃样品中赤霉酸含量在21.3～71.1 μg·kg-1。本试验建立的方法操作简单，灵敏度和重复性好，可用于甜樱桃果实中赤霉酸含量检测。

设施甜樱桃；赤霉素；高效液相色谱-串联质谱

赤霉素(Gibberellins)是指具有赤霉烷骨架，能剌激细胞分裂和伸长的一类化合物的总称，属于双萜类的植物内源激素，由四个异戊二烯单位组成，有四个环，环上各基团的变化组合形成了各种不同活性的赤霉素[1]，现已分离鉴定的有100余种。赤霉素是一种高效能的广谱性植物生长促进物质，在落叶果树上应用广泛，具有诱导无子果实的形成、提高坐果率、防止落花落果、促进果实早熟和打破休眠的调控作用；还能改变一些植物雌雄比率，并使某些二年生植物在当年开花[2]。

甜樱桃设施栽培实际生产过程中，由于设施内生长环境的改变，果实成熟期提前，营养生长期拉长，加上管理不及时，低温伤害、授粉受精不良、落花落果、隔年结果等现象时而发生，不能保证其安全生产，严重影响到果农的经济收入。因此，在有些地区，果农通过使用以赤霉素为主的复合坐果剂替代授粉，辅助果实发育。赤霉素是一种低毒的植物激素类农药，尽管毒性不大，但是长期、大量、不合理使用也会对人类身体健康产生不利影响，目前我国尚未出台农产品中赤霉素残留检测的国家标准。因此，开展农产品如水果、蔬菜中赤霉素残留量检测方法的研究具有重要意义[3]。

目前赤霉素的检测方法有毛细管气相色谱法[4]、高效液相色谱法[5]、气质联用法[6]、毛细管电泳-质谱联用法[7]和酶联免疫法[8]等，有些前处理步骤较为繁琐，有些方法灵敏度低。本研究建立了甜樱桃果实赤霉素含量的HPLC-MS/MS定性定量检测方法，并测定了5份设施甜樱桃样品中的含量，为开展赤霉素的安全性研究提供了参考。

1 材料与方法

1.1试验材料

供试样品采自山东某设施甜樱桃主产区5处大棚，品种均为‘红灯’，树龄5～7年，管理水平中等。每棚随机选取生长势基本一致、结果量较多、无病虫害的植株采样，选取大小均一、成熟度一致的果实样品于-20℃冷冻保存待测。

1.2仪器与试剂

电子天平，粉碎机，高速台式冷冻离心机，旋转蒸发仪，漩涡振荡仪，HPLC-MS/MS(TSQ Quantum Access MAX，Thermo)。

乙腈，甲醇，乙酸乙酯，氯化钠，98%浓硫酸，去离子化纯净水，硫酸水溶液(pH=2.5)，磷酸缓冲溶液(pH=7)。

1.3液相色谱-串联质谱条件

色谱柱：C18柱，150 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：0.15%乙腈-甲酸水溶液(35∶65，V/V)，流速：0.4 mL·min-1；进样量：30 μL。

电喷雾ESI离子源，离子源温度：350℃；反应监测模式SRM；脱溶剂温度：300℃；毛细管电压2.5 kV；辅助气压力2 kV；雾化气、气帘气、辅助气均为高纯氮气，碰撞气为氩气，使用前调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。

1.4样品前处理

称取5.0 g匀浆甜樱桃果肉样品至50 mL离心管中，加入25 mL乙腈和2.0 g氯化钠，涡旋震荡1 min后4 000 r/min离心10 min,下层用乙腈重复提取两次，合并提取液45℃旋转蒸干。用10 mL硫酸-水(pH 2.5)溶液溶解后加20 mL乙酸乙酯，涡旋混合1 min，4 000 r/min离心10 min。乙酸乙酯层转移到烧瓶中，重复提取两次，合并提取液。加10 mL磷酸缓冲溶液(pH 7)于提取液中，涡旋震荡1 min，4 000 r/min离心10 min，磷酸缓冲液层转移到离心管中，重复提取两次，合并磷酸缓冲溶液，用硫酸-水(1∶1)调整提取物pH 2.5，然后加20 mL乙酸乙酯，涡旋1 min，4 000 r/min离心10 min，将乙酸乙酯层转移到烧瓶中，重复提取两次，合并提取物，45℃旋转蒸发近干。加甲醇-水(1∶1)10 mL，涡旋混合60 s ，经0.45 μm滤膜过滤到玻璃LC小瓶中，滤液进行HPLC-MS/MS分析。

2 结果与分析

2.1赤霉素GA3的定性和定量检测

以保留时间和离子对进行赤霉素GA3定性检测。样品保留时间为3.67 min。由表1可知，样品中选择的3个离子丰度和标准品离子丰度比基本一致，则判断该样品中含有GA3。

表1 离子丰度比判定标准 (%)

图1 GA3标准品总离子流色谱图

图2 GA3的3个碎片离子丰度信息

表2 GA3的HPLC-MS/MS测定参数

注：“*”定量离子。

图1和图2分别为GA3标准品的总离子流色谱图和碎片离子丰度信息，可看出在所采用的色谱条件下，分析物可以得到很好的分离，未发现杂质峰的干扰。表2为GA3的LC-MS/MS测定参数。综合图2和表2结果，选择m/z=239为定量离子，采用外标法定量，在5.0 ～100.0 μg·L-1范围内，工作曲线线性方程为Y=2441.95X，线性相关系数R=0.9996，方法检出限为1.21 μg·kg-1，定量限为4.03 μg·kg-1；选择3个浓度做添加回收率试验，回收率为87.64%～91.75%，相对标准偏差为8.9%～13.5%。

2.2甜樱桃样品的GA3含量

由表3可看出，5份设施甜樱桃样品中均检出GA3，含量在21.3～71.1 μg·kg-1范围内。

表3 5份设施甜樱桃样品中的GA3测定结果(n=3)

3 讨论

目前欧盟、日本和加拿大等组织和国家已制定了赤霉素的最大残留限量(Maximum Residue Limit，MRL)，欧盟规定赤霉素在58种水果上的MRL为5.0 mg·kg-1，日本规定赤霉素(GA3)在42种水果中的MRL为0.2 mg·kg-1[9，10]，我国目前尚未出台赤霉素限量标准，对照欧盟和日本限量标准，本试验5份甜樱桃样品中的赤霉素含量未超标。

近年来，水果中植物生长激素的残留问题已引起社会的广泛关注。据报道，广东地区330份市售水果和蔬菜中植物生长调节剂的检出率为55.5%，赤霉素检出数为24个，含量在0.996 ～54.6 μg·kg-1[11]；吉林省75份市售水果赤霉素检出率为10.67%，含量为2.77～506 μg·kg-1[12]。目前我国标准化规模种植果园所占比例较少，仍以小农散户为主，部分果农对于植物生长调节剂认识不足，盲目增加植物生长调节剂的使用浓度和使用次数等情况还难以完全杜绝，果品存在一定的食用安全风险。因此，建议国家加强安全标准研究，完善植物生长调节剂检测标准体系，规范果品的标准化生产。

4 结论

本试验主要围绕甜樱桃果实中赤霉素GA3的检测方法展开，目标是满足实际样品分析需要的前提下，建立简便、快速、高效的植物样品中GA3检测方法。在此基础上，建立了GA3的液液分配提取、净化前处理方法和HPLC-MS/MS分析方法，并将其应用于实际甜樱桃样品的分析中。添加回收试验结果表明该方法重现性好、灵敏度高，具有较高的应用价值，5份设施甜樱桃样品中GA3含量为21.3～71.1 μg·kg-1。

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DeterminationofGibberellinContentinSweetCherryFruitunderProtectedCultivationbyHPLC-MS/MS

Zhang Qian1,2, Du Haiyun3, Jia Houzhen1, Wang Minglin2, Xin Li1

(1.ShandongInstituteofPomology,Taian271000,China; 2.DepartmentofFoodScienceandEngineering,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271000,China;3.TaianCenterforFoodandDrugControl,Taian271000,China)

A qualitative and quantitative determination method for gibberellin content in sweet cherry fruit was developed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The sample was extracted by acetonitrile, and purified by liquid-liquid distribution method, then the sample solution was qualitatively and quantitatively detected by HPLC-MS/MS with SIM mode. The results showed that the quantification limit for gibberellin was 4.03 μg·kg-1, the gibberellin standard showed a good linearity in the range of 5.0～100.0 μg·L-1with the correlation coefficient of 0.9996.The average recovery of gibberellin was 87.64%～91.75%, and the relative standard deviations was 8.9%～13.5%. The gibberellin contents in 5 samples were 21.3～71.1 μg·kg-1. This method was simple to operate with high sensitivity and good reproducibility. It could be used to determinate the gibberellin content in sweet cherry fruit.

Sweet cherry under protected cultivation; Gibberellin; High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)

S662.5

A

1001-4942(2017)10-0117-04

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.025

2017-08-29

山东省现代农业产业技术体系水果创新团队建设项目(SDAIT-06-13);山东省农业重大应用技术创新项目——樱桃采后商品化处理设备研制与试验示范;泰安市科技计划重大专项(201340629)

张倩,山东淄博人,在读博士，从事果品贮藏加工方面的研究。E-mail:cherryzhang2006@126.com

辛力，研究员，主要从事果品贮藏保鲜与加工利用研究。E-mail：sdxinl：@foxmail.com