石榴果皮POD基因的克隆与序列分析

冯立娟+焦其庆+尹燕雷+杨雪梅+程云

摘要：本研究以‘泰山紅石榴果实为试材，利用RT-PCR和RACE技术克隆果皮中POD基因cDNA片段，利用BLAST和ORF Finder分析其核苷酸序列，并利用ProtParam、SPOMA、DANMAN等软件分析其氨基酸序列。结果表明，克隆得到1 092 bp的cDNA片段，该基因含828 bp的CDS序列，编码276个氨基酸。该基因核苷酸序列与烟草、茜草、花生二倍体杂生种和潘那利番茄等植物的相似性分别为77%、77%、76%和76%；氨基酸序列与荔枝、克莱门柚、苹果和白梨的相似性分别为89%、87%、84%和84%；GenBank登录号为KY129694。预测蛋白质理论分子量为30 582.59 D，等电点（pI）为8.83，具有过氧化物酶完整的保守结构域，含有Cd00693和 Cl00196两个保守功能域，为亲水性蛋白；蛋白质二级结构主要由无规则卷曲（38.41%）、α-螺旋（37.68%）、延伸链（13.77%）和β-转角（10.14%）组成。该研究结果为揭示石榴果实褐变机理奠定了理论基础。

关键词：石榴；POD基因；RT-PCR；克隆；序列分析

中图分类号：S665.4 文献标识号：A文章编号：-4942（2017）03-0016-05

AbstractThe cDNA sequence of POD was cloned from Taishanhong pomegranate peel by RT-PCR and RACE technique. The nucleotide sequence of POD was analyzed by BLAST and ORF Finder. The amino acid sequence of POD was analyzed by ProtParam， SPOMA and DANMAN softwares. The results indicated that 1 092 bp cDNA sequence of POD was obtained. It contained 828 bp CDS sequence and encoded 276 amino acids. The similarity of POD nucleotide sequence in pomegranate with Nicotiana tabacum， Rubia cordifolia， Arachis ipaensis and Solanum pennellii was 77%， 77%， 76% and 76%， respectively. Based on the deduced amino acid sequences of POD genes， the similarity of pomegranate with Litchi chinensis， Citrus clementina， Malus domestica and Pyrus bretschneideri was 89%， 87%， 84% and 84%， respectively. The GenBank accession number was KY129694. The theoretical molecular mass of POD protein was 30 582.59 D， and the isoelectric point was 8.83. The protein of POD gene was hydrophilic protein， which had the complete conservative structure domain of peroxidase， and contained two conservative functional domains， Cd00693 and Cl00196. The secondary structure of POD protein was composed by random coil （38.41%）， α-helix （37.68%）， extended strand （13.77%） and β-turn （10.14%）. The results established a theoretical foundation for revealing the mechanism of peel browning in pomegranate fruit.

KeywordsPomegranate； POD gene； RT-PCR； Cloning； Sequence analysis

过氧化物酶（peroxidase，POD）是植物中普遍存在的一类氧化还原酶，它既可以还原细胞内积累的H2O2，也可以降解逆境和生长条件下的活性氧[1，2]。POD由一大类基因家族编码，通过内质网运输到其他组织细胞或亚细胞部位，调控植物生长发育[3，4]。大量研究表明， POD在植物形态建成[5]、木质素代谢[6]、组织褐变[7]和逆境响应[8]等方面起重要作用。

石榴（Punica granatum L.）是我国重要的果树树种之一，其果实富含可溶性酚类物质，保健功能强，越来越受到消费者青睐[9]。果实褐变是石榴极易发生的生理病害，严重影响其商品价值，制约其产业发展[10]。石榴褐变是酚类物质在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和POD等一系列酶作用下，酶与底物区域化被解除而发生的[11]。从生理生化角度已证实，POD是荔枝和龙眼果实褐变的主导酶类[12]，其与石榴果皮褐变也存在密切正相关关系[13]。但在分子水平关于石榴果实POD基因与褐变关系方面的研究国内外尚未见报道。目前，GenBank登录的POD基因序列有1 000多个，已从数百种物种中克隆到POD基因，如荔枝（Litchi chinensis Sonn）[7]、山楂（Crataegus pinnatifida）[14]和鸭梨（Pyrus bretschneideri Rehd cv. Yali）[15]等多种果树作物的POD基因已被分离出，但石榴POD基因及相关信息还未见报道。因此，本研究以‘泰山红石榴为试材，利用RT-PCR和RACE技术克隆其POD基因cDNA片段，并进行生物信息学分析，为从分子水平揭示石榴果实褐变机理提供理论依据。

1材料与方法

1.1試验材料

以山东主栽石榴品种‘泰山红幼果（果实直径2～3 cm）为试材，果实洗净擦干后，用削皮刀取果皮，液氮速冻后放入-80℃冰箱保存备用。

1.2试验方法

1.2.1总RNA提取和cDNA第一链的合成采用RNA prep Pure Plant Kit试剂盒（DP441，北京天根生化有限公司）提取石榴果皮总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，采用Nanodrop 紫外分光光度计测其OD值。采用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（Code No. DRR019S）合成cDNA第一链。

1.2.2石榴POD基因的克隆根据已知物种POD基因同源序列中间片段设计简并引物F1和R1（表1），以合成的cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系总体积50 μL：2 × Ex Taq buffer 25 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，上、下游引物各1.5 μL，cDNA 5 μL，Ex Taq酶1 μL，灭菌蒸馏水15 μL。反应条件为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸 1 min，35个循环；72℃保温10 min，4℃保存。

分别设计3′ RACE引物和5′ RACE引物（表1），进行3′ RACE 和5′ RACE 扩增，步骤参照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（634923，Clontech）和5′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0（18374-058，Invitrogen）试剂盒说明。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收纯化目的片段，并连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，测序获得包含ORF的基因序列。

1.2.3生物信息学分析利用DNAMAN对克隆获得的中间片段、3′ RACE和5′ RACE序列进行拼接，并进行多序列比对和同源性分析；利用ORF Finder预测拼接序列的开放阅读框和编码的蛋白质序列；利用NCBI的BLASTN和BLASTP分析拼接序列核苷酸和氨基酸序列的相似性；用CDD进行蛋白保守结构域分析；利用Expasy Protparam分析该蛋白质的理化性质；利用ProtScale分析蛋白质的疏水性/亲水性；利用SOPMA对蛋白质的二级结构进行预测。

2结果与分析

2.1石榴POD基因cDNA片段克隆

以天根RNA prep Pure Plant Kit试剂盒提取石榴果皮RNA，以反转录cDNA为模板，利用简并引物F1和R1进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在350 bp左右出现特异性条带，测序结果显示该序列长313 bp （图1A）。用3′ RACE特异引物进行3′端序列扩增，获得约400 bp的3′端序列，测序结果表明3′端为351 bp （图1B）。用5′ RACE特异引物进行5′端序列扩增，获得约500 bp的5′端序列，测序结果表明5′端为477 bp。

将中间片段、3′端和5′端序列进行拼接，得到一条长度为1 092 bp的cDNA片段。该基因含828 bp的CDS序列，编码276个氨基酸。BLAST分析表明，该基因片段的核苷酸序列与烟草（Nicotiana tabacum）（XM_016619089.1）、茜草（Rubia cordifolia）（HM807270.1）、花生二倍体杂生种（Arachis ipaensis）（XM_016328124.1）和潘那利番茄（Solanum pennellii）（XM_015208577.1）等植物的相似性为77%、77%、76%和76%；编码的氨基酸序列与荔枝（Litchi chinensis）、克莱门柚（Citrus clementina）和胡杨（Populus euphratica）的相似性分别为89%、87%和86%，与白梨（Pyrus bretschneideri）、苹果（Malus domestica）、巨桉（Eucalyptus grandis）的相似性均为84%，与葡萄（Vitis vinifera）和梅花（Prunus mume）的相似性均为83%，与碧桃（Prunus persica）的相似性为82%（图2）。这表明克隆到的片段为石榴果皮POD基因，GenBank登录号为KY129694。

2.2保守结构域分析

CDD分析表明，石榴POD蛋白具有过氧化物酶完整的保守结构域，包括血红结合位点、活性位点、底物结合位点、钙离子结合位点（图3）。还含有两个保守功能域Cd00693（secretory peroxidase，分泌性过氧化物酶）和 Cl00196（plant-peroxidase-like superfamily，植物过氧化物酶超家族）。进一步证明所获得基因是石榴的过氧化物酶基因。

2.3蛋白理化性质分析

ProtParam分析表明，石榴POD编码蛋白的分子质量为30 582.59 D，等电点（pI）为8.83，分子式为C1334H2120N390O411S12；负电荷氨基酸残基总数（Asp+Glu）为28，正电荷氨基酸残基总数（Arg+Lys）为33，不稳定系数为41.19，是一类不稳定蛋白，脂溶性指数为79.17，亲水性平均数为-0.389。

ProtScale分析表明，POD蛋白存在明显的疏水区和亲水区，其中第133位最高，为2.122，第44位最低，为-2.733，为亲水性蛋白（图4）。

2.4二级结构预测与分析

利用SOPMA 软件预测石榴POD编码蛋白的二级结构表明，有104个氨基酸参与形成α-螺旋（alpha helix），占总氨基酸的37.68%；有106个氨基酸参与形成无规则卷曲（random coil），占总氨基酸的38.41%；有38个氨基酸参与形成延伸链（extended strand），占总氨基酸的13.77%；有28个氨基酸参与形成β-转角（beta turn），占总氨基酸的10.14%（图5）。这说明，石榴POD基因编码蛋白的二级结构中含有丰富的α-螺旋和无规则卷曲。

3讨论与结论

POD是一種由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白，大约由300个氨基酸残基组成，广泛存在于动物、植物和微生物体内[14]。本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆得到石榴果皮POD基因cDNA片段，含828 bp的CDS序列，编码276个氨基酸，但未获得POD基因全长，这主要是由于石榴果皮富含酚类、鞣质、糖酸等物质，RNA纯度低及部分序列发生降解使获得的5′端序列不完整。下一步将改进试验方案，提高RNA纯度，降低RNA降解率，进一步克隆得到POD基因全长序列。

研究表明，POD分为三类，第Ⅰ类存在于线粒体、叶绿体及细菌中，第Ⅱ类存在于真菌中，第Ⅲ类是植物中典型的过氧化物酶，含有4个保守的二硫键和2个保守的钙离子结合位点[16]。本试验克隆的石榴POD蛋白具有过氧化物酶完整的保守结构域，属于植物血红素依赖的过氧化物酶，是第Ⅲ类过氧化物酶的成员。石榴POD蛋白具有Cd00693和 Cl00196两个保守功能域，是分泌过氧化物酶，这与鸭梨[15]和荔枝[16]上的研究结果一致。蛋白质的功能在很大程度上取决于其空间结构，本研究中，POD蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主，这为深入研究该酶的功能奠定了理论基础。

前人对POD基因表达与荔枝果皮褐变间的关系[7，17]进行了探索，但石榴果皮褐变与POD基因表达的关系尚不可知。因此，笔者在获得石榴果皮POD基因cDNA序列的基础上，下一步将重点探讨不同石榴品种果实发育期果皮褐变与POD基因表达的关系，拟从分子水平揭示石榴果皮褐变机理。

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