基因编辑技术在鱼类中的研究及在水产养殖中的应用展望

文/王巍 胡红霞

北京市鲟鱼、鲑鳟鱼创新团队专栏

基因编辑技术是在DNA水平，通过删除、插入等方式对DNA特定序列进行改造的技术。目前人们主要通过锌指蛋白核酸酶技术（Zincfinger nuclease，ZFNs）、类转录激活因子效应物核酸酶技术（transcription activator-like effector，TALENs）和CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein-9 nuclease）等技术来实现编辑基因的功能。随着全基因组测序工作成本的降低，水产生物后基因组时代到来，基因编辑技术在水产生物领域应用得到较快发展。迄今已在斑马鱼、青鳉等模式鱼类和罗非鱼、虹鳟、鲤鱼、沟鲶、野鲮、半滑舌鳎和黄鳝等水产经济鱼类中建立了高效的基因编辑技术。

一、基因编辑技术

ZFNs是一种人工改造的核酸内切酶，能够定点识别DNA双链位置并进行酶切的重组蛋白。它主要是由锌指蛋白构成的DNA识别域和非特异性核酸内切酶FokⅠ两部分组成，前者特异性识别核酸序列，后者随机地切割DNA双链。2008年Doyon和Meng首次分别在斑马鱼中成功实现ZFN介导的基因敲除，得到了kdrl、slc24a5和ntl基因的突变体，其中超过30%～50%的个体能将突变遗传给子代，子代中突变型个体有7%～18%。理论上，ZFNs可以针对任何序列编辑，但其需要构建庞大的锌指表达文库，操作复杂，成本昂贵因而未能得到大规模应用。随着第二代核酸酶技术的出现，ZFNs技术逐步被第二代核酸酶技术所取代。

TALEN技术是第二代人工核酶技术，基于TALE结构域的基因打靶技术。由特异性的TALE DNA结合结构域和非特异性的FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。用TALEN对斑马鱼基因进行编辑后，携带基因突变的斑马鱼可以通过生殖细胞稳定传递到下一代，这为TALEN技术在其他脊椎动物的应用提供了实验依据。Yeh实验室和Joung实验室利用REAL法构建的TALEN在斑马鱼体细胞中得到了hey2和gria3a的突变，突变效率为11%～33%。张博实验室利用单元组装法构建的TALEN对tnikb和dip2a两个基因成功编辑，并且获得了可以稳定遗传的斑马鱼突变体。相对于ZFN技术，TALEN具备比ZFN更明显的先天优势，比如TALEN结合DNA的方式更便于预测和设计；TALEN的构建更加方便、快捷，甚至能够实现大规模、高通量的组装；TALEN的特异性比ZFN高，而毒性和脱靶效应则比ZFN低。但是构建周期长，成本较高，且识别位点受到胸腺嘧啶的制约，难以进行多靶点编辑。

CRISPR/Cas系统是多数细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统，可将外源基因片段插入基因组中作为“记忆”，以消灭再次入侵外源DNA。该系统全名为成簇的规律间隔的短回文重复序列/成簇的规律间隔的短回文重复序列关联蛋白系统。根据Cas蛋白种类不同，CRISPR/Cas系统分I，II，III型。目前最常用的是II型CRISPR/Cas9系统，包含Cas9蛋白和向导RNA。2013年Hwang等首次在斑马鱼上实现用CRISPR/Cas9系统高效的基因编辑。ZFN和TALEN技术都需要合成能够与特异DNA序列结合的蛋白模块，操作繁琐费时。CRISPR/Cas技术则使用一段向导RNA引导核酸内切酶到靶点处就能完成基因组编辑。与ZFN和TALEN技术相比，CRISPR/Cas9技术设计简单，成本低廉，构建周期短，可以进行多靶点编辑且靶向修饰效率高，基本适应所有类型的细胞和生物体，但仍存在脱靶率不确定等问题。

二、基因编辑技术在水产养殖鱼类中的应用

水产养殖鱼类是优质蛋白的重要来源，开展养殖鱼类基因功能研究，揭示其遗传发育规律，发掘和利用遗传资源培育高产、抗病抗逆品种，不仅具有重要的科学意义也可以有效提高水产养殖经济效益。近十余年来，随着高通量测序技术的发展，鲤鱼、斑点叉尾鮰、半滑舌鳎、牙鲆、草鱼、翘嘴红鲌、团头鲂、尼罗罗非鱼、青鳉、大黄鱼、大西洋鲑、大西洋鳕、石斑鱼等多种水产养殖鱼类的基因组已被测序，还有更多的水产养殖鱼类正在开展测序工作，为基因编辑在水产养殖鱼类中的应用提供了丰富的遗传信息资源。

利用ZFNs技术对鲶鱼的促黄体激素进行编辑，Dunham等得到的后代具19.7%的变异率，且是不育个体。胡炜研究组利用CRISPR/Cas9技术对黄鳝的foxl2和cyp19a1a基因进行编辑，得到杂合性F0代，基因表达降低，dmrt1表达升高，性内分泌激素雌二醇降低。胡红霞研究组首次通过在小体鲟胚胎中同时转入红色和绿色荧光蛋白载体，利用TALENS和CRISPR/Cas9进行编辑获得具有单一荧光的后代，实现了基因编辑技术在多倍体鲟鱼中的应用。同时还对小体鲟的ntl基因进行编辑，在F0代就得到了尾部弯曲的个体。陈松林等编辑半滑舌鳎dmrt1基因，得到具有类雌性性腺的雄性，而且还出现兼性个体，证明dmrt1是半滑舌鳎雄性性别决定的关键基因。通过对性别控制相关基因的编辑，可以得到性逆转后代。王德寿研究组通过TALENs编辑了尼罗罗非鱼的dmrt1、foxl2和cyp19a1a基因，能得到性逆转的雌鱼或雄鱼后代，极大的缩短了全雄育种时间。利用CRISPR/Cas9技术，Wargelius等在F0代就得到了浅色的大西洋鲑品种。利用CRISPR/Cas9对mstnba基因编辑，王晗研究组发现三月龄内的鲤鱼体长和体重都显著增加。

三、基因编辑技术在水产养殖鱼类研究中存在的问题及应用展望

基因编辑技术不仅在斑马鱼、青鳉等模式鱼类中展开深入研究，而且可以广泛地应用到经济鱼类中，例如防止品种退化、生长速度下降、抗性降低、繁殖力降低等不良现象。新型基因编辑技术不仅可以敲除基因，揭示基因功能和内在机理，还可以高效、定向地编辑目的基因，显著地缩短了育种时间，较之传统的转基因技术更加安全。

从目前的报道来看，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas系统基因编辑方法均存在脱靶问题，会引起基因组的重排或无法预测的突变。如何降低脱靶率和增强特异性成为改良基因编辑技术的主要问题。基因编辑技术是针对基因组DNA，主要通过显微注射等方法对细胞系或胚胎进行操作，而水产养殖鱼类细胞系较少，一定程度上限制了基因编辑技术的推广应用。多数鱼类是卵生，进行显微注射技术和去卵膜操作时难度大，成功率低，成为制约水产养殖鱼类基因编辑技术应用的主要因素。对于卵胎生鱼类，目前在操作上尚没有可以适用的基因编辑技术可以应用。

尽管目前基因编辑技术在水产养殖鱼类中还存在一定程度的技术难度，没有广泛应用，但是随着鱼类基因组信息和遗传资源的不断挖掘，有望利用基因编辑技术更加快速有效的获得高产、单性及抗病抗逆等优良性状新品种，甚至在鱼类构建疾病模型、进行药物筛选和环境监测等方面发挥作用。