河北省区域试验大豆品系指纹图谱构建遗传相似性分析及纯度鉴定

徐冬雪，史晓蕾，闫 龙，刘兵强，邸 锐，陈 强，张孟臣，刘志芳，杨春燕*

（1.河北省农林科学院粮油作物研究所，河北省作物遗传育种实验室，国家大豆中心石家庄分中心，农业部黄淮海大豆生物学与遗传育种重点实验室，河北 石家庄 050035；2.河北省种子管理总站，河北 石家庄 050031）

大豆是我国重要的粮食和油料作物，也是植物蛋白质的主要来源。随着生活水平的提高和外贸事业的发展，人们对大豆的产量和品质要求越来越高。目前我国的大豆来源主要依赖于国外，进口大豆数量居高不下。为扭转这一局面，我们应加快大豆新品种的研究与推广。育种是实现大豆高产、优质、高效的重要途径之一，鉴定大豆新品种实现大豆高产、优质、高效，为国家大豆新品种审定推广提供依据。

充分了解试验大豆品系的遗传多样性和品系纯度，对于新品种审定、保护及种质材料评价等具有重要意义。传统的形态学标记对大豆品种的鉴定，不能对其基因DNA遗传进行深入研究。SSR标记因标记数量丰富、操作简便、结果重复性好，被广泛应用于作物品种的鉴别研究。张博等[1]利用18个SSR引物对来自6个省（市）的10个育成大豆品种进行遗传分析，根据遗传距离将10个亲本聚为两类，平均遗传距离为0.835。秦君等[2]利用60个SSR标记对黑龙江省140份代表性大豆种质进行遗传多样性分析，在遗传距离为0.24时，将参试品种分为两大类群。朴向民等[3]利用9对多样性较高的SSR引物对来自中国吉林省（36份）和韩国（10份）的野生大豆材料进行遗传多样性分析，在遗传相似系数为0.68的水平上，将76份材料分为两大类群。关荣霞等[4]利用SSR标记对4个品种材料进行纯度检测验证，发现品661纯度最高，达到了99.0%。关荣霞等[5]利用30对SSR引物对2005～2009年参加国家区域试验的1 068份大豆品种进行位点纯合度检测发现，位点纯合度低的品种，在区域试验中产量也较低。杨凯敏等[6]利用59个SSR标记对90份大豆种质资源进行遗传多样性分析，在遗传距离0.805处将90份材料分为了三大类群。徐海风等[7]利用6对SSR引物对26份菜用大豆构建了指纹图谱，26份菜用大豆品种（系）间遗传相似系数的变异范围为0.61～0.88。何琳等[8]利用5对引物SSR标记对94份北方春大豆国家区试品种构建了指纹图谱，纯度分布范围为53.85%～100.0%，平均纯度为99.02%，平均遗传相似系数为0.278 3。贾艳晓[9]利用30对SSR引物和10对AFLP引物构建了41个河北省大豆推广品种的DNA指纹图谱。

前人研究中，关于河北省区域试验大豆品系指纹图谱构建、遗传相似性分析及纯度鉴定的报道较少。为有效指导河北省大豆新品种的选育和推广，以参加2016年河北省区域试验的21份大豆品系为试材，利用SSR分子标记技术鉴定参试大豆品系的纯度、构建指纹图谱，为品种纯度、真伪鉴定和新品种保护提供理论依据，从而维护育种者的品种权和消费者的利益；分析参试大豆品系间遗传相似性，明确大豆品种间亲缘关系的远近，为亲本选配、后代选择及杂种优势水平的预测提供指导[10]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为参加2016年河北省大豆区域试验的21个品系（表1）。每份材料均取30粒种子，在营养钵中用蛭石发芽，待真叶展开后，从20个单株上各摘取1片真叶，放入2 mL离心管中，液氮保存，备用。

表1 2016年河北省大豆区域试验的21个品系Table 1 21 soybean lines in the regional test of Hebei Province in 2016

1.2 试验方法

1.2.1 SSR引物筛选 参照全基因组测序开发的SSR标记（https：//www.soybase.org/）。从20条染色体随机选取62对SSR引物对21份大豆品系进行PCR扩增，从中筛选出PCR产物条带清晰的引物对21份大豆品系进行指纹图谱构建和纯度检测。

1.2.2 DNA的提取及SSR扩增 采用CTAB法[11]提取基因组DNA，利用NanoDrop 2000超微量分光光度仪测定其浓度，采用琼脂糖凝胶电泳检测模板DNA质量。将DNA样品稀释到30 ng/μL，4℃冰箱保存，备用。

利用德国BIOMETRO PCR仪进行PCR反应。PCR反应程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸30s；重复步骤2～4，共36个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上用1/3×TBE缓冲液进行电泳分离，银染，氢氧化钠和甲醛显色。拍照并记载位点。

1.2.3 统计分析 根据PCR扩增产物的结果，视每对SSR引物为1个位点，每条多态性带为1个等位基因；在相同迁移率位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，缺失记为“9”；按Nei等[12]方法计算遗传相似系数（GS）和遗传距离（GD）：

式中，Mxy为品系x和品系y在所有检测位点上共有片段的数目（个），Mx为品系x在所有检测位点上的总片段数（个），My为品系y在所有检测位点上的总片段数（个）。

根据遗传相似性系数，利用SAHN程序[13]和非加权类平均法（UPGMA）[14]对遗传相似性进行聚类，并绘制树状图。根据Smith等[15]方法，计算每对SSR引物的多态性信息含量指数（PIC）：

式中， ∫i表示第i位点的等位基因频率。

参照中华人民共和国农业行业标准《大豆品系纯度鉴定技术规程》（NY/T 1788—2099），如果SSR位点出现单一条带，说明品系纯合；如果出现2个或多个条带的位点，则认为该品系在该位点杂合。根据公式计算品系纯度（P）：

式中，P为品系纯度（%），S1为检测SSR位点数（个），S2为杂合位点数（个）。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性及指纹图谱构建

选取62对SSR引物对21份大豆品系进行PCR扩增，筛选出具有多态性丰富、条带清晰的引物19对，共扩增片段大小为300～1 000 bp的DNA条带93条，每对引物扩增的条带数为3～8条，平均5.50条，其中，多态性DNA条带73条，多态性比率为78.50%。SSR引物的PIC值变幅为0.44～0.88，其中Satt255的PIC值最高、Satt174的PIC值最低，平均值为0.67。

通过统计分析，选取条带清晰且PIC值高的3对SSR引物对21个大豆品系的DNA指纹图谱进行构建。这3对引物共扩增出21条DNA条带，其中16条为多态性条带，平均PIC值为0.78（表2）。进一步将3对引物对21个品系指纹图谱加以数字化，形成矩阵（表3）。分别单独利用SSR引物Satt216、Satt175和Satt125，根据带型组合，可以将21个品系分成9、9和6种类型。利用引物组合Satt216与Satt175可以将21个品系中的15个品系精确区分，利用Satt216与Satt125可以将21个品系中的13个品系精确区分，利用引物组合Satt125与Satt175可以将21个品系中的12个品系精确区分，联合应用这3对引物可以将21个品系中的每一个品系精确区分。

表2 SSR分析结果Table 2 Results of SSR analysis

2.2 遗传相似性分析

利用SNTSYS-pc 2.1软件[16]对21个大豆品系19对SSR引物检测到的93个位点进行聚类分析，建立聚类树状图（图1）。品系间遗传相似系数变幅为0～8.20，平均值为0.63，遗传相似系数的变异范围为0.61～0.82。以遗传相似系数0.64为阈值可以将21份品系分为3个群，其中，第一类群仅包含石641，第二类群包含邯11-114、石豆14和冀1504等16个品系，第三类群包含沧豆13、沧豆11和沧豆0734等4个品系。由此可见，21个大豆品系间的遗传变异较小，遗传相似性高。

2.3 种子纯度检测

利用筛选的2对SSR引物（Satt216、Satt114）对21个大豆品系的420粒种子（每品系均20粒）进行纯度检测，结果（表4）显示，纯度100%的品种有11个，分别是石641、冀1503、邯13-99、沧豆11、冀1514、农大鉴1501、石76368、HN0906、邯11-222、石153和冀13BB9；纯度97%的品种仅1个，是沧豆13；纯度95%的品种有5个，分别是邯11-114、冀1504、冀1507、沧豆0734和邯12-383；纯度90%的品种有3个，分别是HN0811、邯12-298和石豆14；纯度低于90%的品种仅1个，是石豆15，其纯度为85%。21个大豆品系种子纯度的分布范围为85%～100%，平均纯度97%。

表3 利用3个标记对21个大豆品系构建的DNA指纹图谱Table 3 DNA fingerprints of 21 soybean lines with 3 SSR markers

图1 21个大豆品系的SSR标记遗传聚类图Fig.1 Dendrogram of 21 soybean lines based on SSR genetic distance

3 结论与讨论

本研究结果显示，品种指纹图谱的构建可以为品种鉴别提供理论依据。根据各品种指纹的不同进行聚类分析，可以了解品种间的亲缘关系和遗传距离，为培育新品种提供参考。利用多态性丰富、条带清晰的3对SSR引物（Satt216、Satt175和Satt125）构建的指纹图谱即可将21个大豆品系完全区分；通过对参加2016年河北省区域试验的21份品系进行遗传相似性分析发现，品系间遗传相似系数变幅为0～8.20，平均0.63，遗传相似系数的变异范围为0.61～0.82。以遗传相似系数0.64为阈值可以将21份品系分为3个群，其中，第一类群与其他2种类群中品种的遗传相似性系数均为0，其他2个类群品种的遗传相似系数范围为0.61～0.82。遗传相似度较高，说明品种间遗传变异较小。这可能与不同育种单位组配杂交组合时选用的亲本材料遗传背景比较相近相关，在一定程度上导致大豆遗传基础比较狭窄。

表4 21个大豆品系种子纯度检测结果Table 4 Purity of 21 soybean lines

Xie等[17]利用67对SSR引物对158份中国夏季大豆进行遗传多样性分析，中国夏季大豆品种的遗传相似性系数分布范围为0.41～0.91，平均0.74；黄淮海地区夏季大豆品种的遗传相似性系数分布范围为0.39～0.89，平均0.71；南方地区夏季大豆品种的遗传相似性系数分布范围为0.19～0.88，平均0.69。贾晓艳等[18]利用30对SSR引物对41个大豆品种进行扩增后检测出135个等位变异，SSR的遗传多样性指数变化范围为0.09～0.78，平均0.64。10对AFLP引物扩增出93个多态性标记，品种间的遗传相似系数分布范围为0.59～0.99，平均值0.72，遗传相似系数较高。徐海风等[19]利用45对引物对大豆品种的遗传相似性进行分析，43份大豆品种的遗传相似系数分布范围为0.56～0.96。杨加银等[20]利用46对SSR引物对3个淮豆系列品种及8份骨干亲本品种，采用非加权平均法聚类分析，遗传相似系数为0.58～0.96。本研究结果显示，参加2016年河北省区域试验的21个大豆品系遗传相似系数均比较大，与上述研究结果比较相似。因此，了解参试大豆品种的遗传背景可减少亲本选配的盲目性，为利用种质资源进行育种工作提供参考依据。

本研究中，利用SSR分子标记技术对2016年河北省区域试验的21个大豆品系进行种子纯度鉴定，结果显示，品种纯度分布范围为85%～100%，平均纯度97%，其中，纯度高于90%的品种有20个。有1个品种纯度低于90%，这可能是因为大田异花授粉出现杂株，或是因为育种世代等原因，导致某些SSR等位变异；也可能是微卫星在复制过程中出现变异[21]，致使纯度鉴定仅在分子水平上难以判断。由于标记密度的影响，在形态学上鉴定出的杂株不一定在分子水平上能鉴定出是杂株，而在形态学上的正常株却有可能在分子水平上被鉴定成杂株[22]。因此，对于参试的大豆品系应该从形态学和分子水平两方面相结合来鉴定，以确保参试材料纯度的准确性。

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