近红外光谱法非破坏性测定绿豆籽粒粗蛋白质含量的研究

曹志敏，张志肖，王彦，范保杰，刘长友，苏秋竹，张丽，田静

（河北省农林科学院粮油作物研究所，河北石家庄050035）

近红外光谱法非破坏性测定绿豆籽粒粗蛋白质含量的研究

曹志敏，张志肖，王彦，范保杰，刘长友，苏秋竹，张丽，田静*

（河北省农林科学院粮油作物研究所，河北石家庄050035）

为了找到一种快速、简单的测定绿豆品质的方法，利用瑞典波通（Perten）公司生产的DA7200二极管阵列近红外光谱仪，以来自我国绿豆主产区的77份绿豆资源为试验材料，对样品进行光谱扫描，并测定了直链淀粉含量的参比数据。结果表明：定标集和检验集样品的蛋白质含量预测值与化学测定值之间均呈极显著的正相关，相关系数分别为0.9772和0.9631；所建定标模型具有较高的预测精度。本研究利用近红外光谱仪对完整绿豆粗蛋白质的分析，可直接用于育种材料选择以及突变体筛选和种质资源的评价等研究。

近红外光谱法；绿豆；粗蛋白质；定标

中国绿豆栽培历史悠久，种质资源丰富，近年来总产量保持在83万～97万t，居世界前列[1]。绿豆除直接作为粮食食用外，还是重要的食品工业原料，可用于制作绿豆芽、绿豆糕和绿豆粉丝等产品。绿豆蛋白质含量为21%～28%，高于主要粮食作物水稻、小麦和玉米，是植物蛋白的重要来源[2]。利用常规方法分析农产品和食品品质时，不仅费时、费力，而且成本高。近红外反射光谱（near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS）技术是近20 a年来发展较快的光谱分析技术之一，具有样品前处理简单、快速，可同时测定1种或多种化学成分含量的特点[3]，已经在农业、食品、石油、化工、医药等多个领域得到了广泛应用[4，5]。近年来，该技术的无损特点尤其引人注目，特别是农作物种子品质测定完成后，样品不仅完好无损，而且还能保持种子活力。因此，NIRS技术在作物育种、种子质量检测、种质资源创新等领域显现出良好的应用前景[6～8]。

NIRS技术用于测定豆类品质研究已经取得了一定进展。Willams等[9]以豆类为试验材料，建立了NIRS的预测模型并应用于豆类的蛋白质育种中。Berardo等[10]利用NIRS技术同时测定了木豆中蛋白质、有机质等6种组分的含量，结果显示，化学值与预测值之间显著性较高（R2＞0.96）。Patil等[11]利用NIRS无破损技术测定了大豆的脂肪酸含量，发现不同类型的脂肪酸含量预测效果有所不同。然而，截至目前，该技术在绿豆籽粒品质鉴定方面的研究尚未见报道。

以77份绿豆资源的籽粒为试材，分别利用化学法和NIRS技术进行粗蛋白质含量测定，以化学法测定值为对照，分析了NIRS技术用于绿豆蛋白质含量测定的准确性及其用于实际检测的可行性，并构建了绿豆蛋白质的近红外模型，以预测绿豆各类材料的蛋白质含量。

1　材料与方法

1.1试验材料

试验绿豆资源共77份（表1），来自中国绿豆主产区河北、河南、湖北、湖南、内蒙古、山西、辽宁等省份，在品种来源、蛋白质含量、农艺特性上具有较好的代表性。2014年6～10月在河北省农林科学院粮油作物研究所堤上试验站统一种植，每份材料均种植2行，行长4.2 m，田间管理同大田常规。绿豆成熟后收获，晾晒、脱粒、清选后，挑选完整籽粒，备用。

近红外光谱仪采用瑞典波通（Perten）公司生产的DA7200二极管阵列近红外光谱仪，带有漫反射旋转样品杯。

1.2试验方法

1.2.1籽粒蛋白质含量的化学测定每份材料均取籽粒50 g，采用NY/T 3—1982《谷类、豆类作物种子粗蛋白质测定法（半微量凯氏法）》[12]，测定籽粒的蛋白质含量。

1.2.2籽粒蛋白质含量的近红外光谱分析

1.2.2.1样品原始光谱数据的采集。对77份绿豆样品在波长950～1 650 nm范围内采集光谱，采样间隔为2.0 nm，光程18，扫描10次，并做样品平行试验，取平均光谱值用于近红外光谱分析。扫描温度控制在21～25℃。

1.2.2.2近红外光谱分析模型的建立。利用定标样品集，比较不同光谱区间和光谱预处理方法对模型定标相关系数的影响，选择合适光谱区间和利用偏最小二乘法预处理方法，以便建立准确的定标模型。

1.2.2.3近红外光谱定标模型的验证。将来自国家食用豆产业技术体系联合鉴定的10个绿豆样品作为验证样品集。以验证集籽粒样品作为未知样品进行预测，比较模型预测值与化学测定值之前的相关性，通过相关系数大小验证模型的预测能力。

2　结果与分析

2.1参试绿豆籽粒蛋白质含量的化学测定结果

参试绿豆材料的籽粒蛋白质含量为22.04%～27.97%（表1），差异较大，平均值为24.68%。样品的蛋白质含量范围基本覆盖了绿豆种质蛋白质含量的常态分布范围，具有良好的连续性与代表性，满足近红外光谱定标条件的要求。

表1　采用化学法测定的绿豆籽粒蛋白质含量（%）Table1　The protein content of mungbean tested by chemical method

2.2定标模型的建立

2.2.1近红外光谱的采集与光谱范围的选择利用近红光谱仪在波长950～1 650 nm范围内扫描77份绿豆样品，得到绿豆籽粒的原始近红外光谱。结果（图1）显示，不同样品的原始吸收光谱形状基本相似。参试绿豆均分别在1 200 nm处和1 450 nm处出现了强烈的吸收峰，与绿豆种子含有较多的淀粉和蛋白质有关。其中，在1 200 nm处出现的强烈吸收峰，应该是C-H键伸缩振动的二级倍频吸收带；在1 450 nm处出现的强烈吸收峰，应该是N-H键伸缩振动的一级倍频吸收带。

由于不同光谱区间的蛋白质吸收强度有所差异，因此，选择的光谱区间会直接影响所建分析模型的准确度。采用1阶求导加散射校正（SNV）的预处理方法对原始近红外光谱进行处理，得到处理后的近红外光谱。结果（图2）显示，77条光谱曲线在波长900～1 200 nm范围内一致性较差；而在波长＞1 200 nm时，光谱趋势相同，一致性较好，未出现光谱异常现象。因此，选取波长＞1 200 nm的光谱区间用于光谱分析与定标模型建立。

图1　绿豆的原始近红外光谱Fig.1　NIR original spectra of all samples

图2　1阶求导垣SNV处理后的绿豆近红外光谱Fig.2　The spectra after 1 derivative垣SNV

2.2.2定标模型的建立利用PLS，依据化学测定结果，通过一元线性回归，得出本研究的定标方程为y=1.09+0.955x（图3），相关系数为0.977 2。可以看出，绿豆蛋白质含量预测值与化学值之间呈极显著的正相关。说明定标集的预测值与化学测定值之间具有显著的线性关系。

2.3定标模型检验

根据验证集样品蛋白质含量的化学测定值和模型预测值（表2），通过线性回归，得到二者之间的相关方程为y=1.015 5x-0.414 8（图4），相关系数为0.963 1，趋势线的斜率为1.105 5，二者均接近于1。说明2种方法测定的结果一致性较高，蛋白质含量预测值与化学测定值较吻合。

图3　绿豆蛋白质含量预测值与化学测定值之间的相关性Fig.3　The correlation of protein content of mungbean tested by two methods

表2　绿豆蛋白质含量化学测定值与模型预测值的比较（%）Table2　Compared of protein content of mungbean tested by two methods

图4　验证样品蛋白质含量化学测定值与模型预测值之间的相关性Fig.4　The correlation of protein content the true and prediction in mungbean

3　结论与讨论

陆艳婷等[13]认为近红外光谱分析建模过程中选择适当的定标样品数量十分重要，数量过多，虽然可以获得准确的预测模型，但前期工作量大；而数量过少，则建模时往往主成分数偏少，易出现过拟合现象，预测效果差。方彦[14]利用40份玉米籽粒应用近红外光谱和偏最小二乘回归法预测了玉米的淀粉含量，校正数据集和独立的检验数据集的预测值与实际测定值之间的相关系数分别达到了0.961 0和0.982 0，所建校正模型具有较高的预测精度和较好的推广性，为快速、无损测定玉米籽粒淀粉含量提供了新途径。本研究以品种来源、蛋白质含量、农艺特性具有较好代表性的77份绿豆资源为试材，采用偏最小二乘法，分析了利用近红外光谱法测定绿豆籽粒蛋白质含量的可行性。结果显示，近红外分析结果与化学测定值之间具有高度的相关性（r=0.977 2），说明所建定标模型具有较高的预测准确性[15]。影响近红外分析准确性的因素有很多[16]，包括样品的组分含量、样品数量、样品的物理特性、样品预处理方法、测试条件和仪器自身等。充分考虑各因素的影响，并采取相应的预防措施，所建立的预测模型将具有更高的可靠性与适用性。为了扩大预测范围，应对模型进行不断地维护，注意搜集绿豆资源，使绿豆样品蛋白质含量能覆盖绿豆生产或育种材料中成分的变化范围，以便进一步优化模型，使定标方程具有广泛的应用范围。

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Non-destructive Test of Crude Protein in Mungbean Grain by Near Infrared Reflectance Spectroscopy

CAO Zhi-min，ZHANG Zhi-xiao，WANG Yan，FAN Bao-jie，LIU Chang-you，SU Qiu-zhu，ZHANG Li，TIAN Jing*
（Institute of Cereal and Oil Crops，Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050035，China）

The feasibility of measuring crude protein contents in intact seeds of mungbean by using near infrared reflectance spectroscopy（NIRS）was studied.In order to find a quick and easy method.The chemometric method of partial least square（PLS）was used.The results showed that there was a remarkable positive correlation between the predicted values and the chemical values.The correlation coefficients to chemical values in calibration set and validation set were 0.977 2 and 0.963 1，respectively.This study can be directly used for breeding material selection，mutant screening and evaluation of germplasm resources of research.

NIRS；Mungbean；Crude protein；Calibration

S522

A

1008-1631（2016）05-0104-05

2016-03-30

国家食用豆产业技术体系项目（CARS-09-G2）；国家“十二五”科技支撑计划项目（2014BAD07B05-03）；河北省农业科技成果转化资金项目（2014GB2A200322）；河北省科技计划项目（14226303D）

曹志敏（1975-），女，河北石家庄人，副研究员，主要从事食用豆育种及产后加工研究。E-mail：baby.cao@163.com。

田静（1964-），女，河北石家庄人，研究员，硕士，主要从事作物育种研究。