亚洲玉米螟的抗药性监测及双酰胺类药剂抗性靶标分子检测

支昊宇，王智慧，王兴仔，丁新华，贾尊尊，郭文超，姜卫华

(1.南京农业大学植物保护学院，南京 210095；2.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091；3.新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)属鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)，是世界性的玉米害虫。该虫可造成玉米10%～30%产量损失，严重时则达到50%以上，对玉米产量和质量产生了严重影响[1]。2014年新疆玉米种植面积为89.07×104hm2(1 366万亩)左右，占其粮食种植总面积的41.02%，亚洲玉米螟(以下简称玉米螟)也是新疆玉米生产上发生最重、危害最大的害虫之一[2]。化学控制是防治该虫的主要方式之一，但随着杀虫剂频繁施用，玉米螟会产生抗性问题[3-5]。双酰胺类药剂作用靶标为鱼尼丁受体(Ryanodine receptor，RyR)，包括氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺等，因其对鳞翅目高效，与其他常用药剂无交互抗性。氯虫苯甲酰胺等的该类药剂逐步推广用于玉米螟的田间防治[2,6]，有关抗性机制的研究有助于为该虫的抗性治理提供技术储备和指导。【前人研究进展】近年来，小菜蛾(Plutellaxylostella)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、二化螟(Chilosuppressalis)、烟粉虱(Bemisiatabaci)等重要农业害虫对氯虫苯甲酰胺和(或)溴氰虫酰胺已产生了不同程度的抗性[7-10]。鱼尼丁受体基因突变和表达量的变化是害虫对双酰胺类杀虫剂产生抗性的重要机制。Troczka等[11]研究发现，对氯虫苯甲酰胺具200多倍抗性的泰国和菲律宾小菜蛾田间种群鱼尼丁受体TM1和TM2跨膜区之间发生点突变，高度保守的第4 946位甘氨酸(GGG)突变为谷氨酸(GAA)，推测G4946E突变可能引起小菜蛾抗药性的产生。Guo等[12]在国内的抗性小菜蛾种群中证实了该突变的存在，又发现云南通海小菜蛾田间种群的鱼尼丁受体基因存在3个新的突变位点，分别是第1 338位的谷氨酸突变为缬氨酸(E1338D)，第4 594位谷氨酰胺突变为亮氨酸(Q4594L)和第4 790位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸(I4790M)，分析抗性遗传连锁及鱼尼丁受体与药剂的结合动力学，这几个突变可通过不同组合参与小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性形成[13]。定量PCR分析发现对氯虫苯甲酰胺产生16.8倍抗性的小菜蛾和室内连续筛选的甜菜夜蛾抗氯虫苯甲酰胺高抗品系(105.6倍)1、2 和4龄幼虫的鱼尼丁受体mRNA表达量都显著高于敏感品系，RyR的表达量变化与氯虫苯甲酰胺诱导有关[14-15]。【本研究切入点】新疆地区近年来玉米螟的危害严重，目前有关玉米螟对双酰胺药剂的抗性研究尚无相关报道。研究玉米螟田间种群对常用药剂的抗性动态。【拟解决的关键问题】测定新疆不同玉米螟田间种群对包含双酰胺类药剂氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺等常用药剂的抗性水平，分析新疆不同田间种群鱼尼丁受体基因表达量和分子序列的差异，研究新疆玉米螟对双酰胺类药剂的靶标抗性分子机制，为指导田间合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试虫源

在2018、2019年3～4月分别于新疆伊宁市、疏勒县、乌鲁木齐市、昌吉市采集玉米螟越冬期老熟幼虫，转至室内利用人工饲料饲养。敏感种群(JZ-S)由河南省济源白云实业有限公司(焦作)2018年12月赠送，室内自2015年不接触药剂饲养至今。养虫室条件为温度(26±1)℃，相对湿度60%，光暗时间为16 h/8 h，抗性测定以3龄幼虫为试虫；收集各种群3龄幼虫，保存在-80℃度冰箱中，用于定量PCR测定以及突变检测。表1

表1 亚洲玉米螟来源及寄主Table 1 Sampling sites and host crop for Ostriniafurnacalis

1.1.2 供试药剂

20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂(Chlorantraniliprole，美国杜邦公司)；10%溴氰虫酰胺可分散油悬浮剂(Cyantraniliprole,美国杜邦公司)；22%噻虫嗪·高效氯氟氰菊酯(阿立卡，Arica)微囊悬浮剂(先正达(苏州)作物保护有限公司)；6%阿维菌素·氯虫苯甲酰胺(亮泰，Langat)悬浮剂(先正达(苏州)作物保护有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 毒力测定

利用人工饲料浸药法测定抗性，利用清水将各制剂按梯度稀释为不同浓度的药液，将人工饲料(2 cm×2 cm)在不同浓度的药液中浸渍10s，取出晾干后放入培养皿(直径9 cm)中，每皿接入玉米螟3龄幼虫10头，以浸泡清水的饲料作为对照。每个处理重复3次。处理72 h后分别检查玉米螟的死亡情况，以毛笔轻触虫体不能正常活动为死亡标准。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成

按照Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)将玉米螟3龄幼虫单头提取总RNA，然后按照Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)说明书合成cDNA，将产物保存于-20℃。

1.2.3 实时荧光定量PCR分析

根据Genebank上玉米螟鱼尼丁受体基因的序列(登录号KC355370)，设计一对特异性引物OfRyF和OfRyR，同时以β-actin作为内参基因[16]。定量PCR反应在荧光定量7500型PCR 仪(美国ABI 公司)进行。按照ChamQTMSYBR®qPCR Master Mix荧光定量试剂盒(南京诺维赞生物科技有限公司)进行反应，用稀释5倍的cDNA为模板，反应体系(20 μL)：2.5×Real Master Mix(SYBR Green)10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，50×ROX Reference Dye2 0.4 μL，去RNA酶ddH2O 7 μL；反应程序：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 35 s，40个循环。阴性对照以去RNA酶ddH2O为模板，每个处理重复4次。利用特异性引物分别对目的基因和β-actin进行荧光定量PCR测定，以稀释度的负对数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立荧光定量PCR标准曲线。

1.2.4 玉米螟鱼尼丁受体基因突变检测

参照小菜蛾鱼尼丁受体(PxRyR)的突变位点E1338D、Q4594L和I4790E[13]，用GENEDOC软件比对得到对应于PxRyR突变位点的OfRyR位点分别为1 424、4 583和4 782，用Primer 5设计引物，由金斯瑞生物技术有限公司合成。突变检测PCR反应体系25 μL，包括2×TaqMaster Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)2.5 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，去RNA酶ddH2O 9.5 μL。反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，根据不同引物Tm值退火30 s，72℃延伸30 s，循环数为35，最后72℃延伸10 min。反应在PCR扩增仪T100(美国BIO-RAD公司)进行。PCR产物由上海杰李公司测序。表2

表2 玉米螟鱼尼丁受体基因引物设计Table 2 Design of primers for OfRyR

1.3 数据处理

死亡率和校正死亡率的计算使用Abbott公式，采用机率值分析法计算毒力回归曲线、LD50值、相关系数及95%置信限，抗性倍数(RR)=测试种群的LC50/相对敏感种群(或敏感种群)的LC50，抗药性水平参照以下标准：RR低于3.0倍为敏感；3.0～5.0倍为敏感性下降；5.0～10.0倍为低水平抗性；10.0～40.0倍为中等水平抗性；40.0～160.0倍为高水平抗性；高于160.0倍为极高水平抗性[17]。

采用2-ΔΔCt方法[18]计算鱼尼丁受体基因相对表达量，利用SPSS 18.0 软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，Tukey进行差异显著性检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 新疆玉米螟种群的抗性监测

研究表明，2018年所有测试种群中乌鲁木齐种群对氯虫苯甲酰胺和阿立卡最为敏感(LC50分别为0.341 6和2.092 2 μg/mL)，与乌鲁木齐种群相比：疏勒种群对氯虫苯甲酰胺为敏感性较低，抗性倍数(RR)为3.67倍，其它种群保持敏感；在所有测试的药剂中，各玉米螟田间种群对阿立卡的敏感性普遍较低，疏勒县、伊宁市和泽普县玉米螟对阿立卡都为中等水平抗性，RR分别为20.17、14.10和10.97倍。所有测试种群中疏勒种群对溴氰虫酰胺和亮泰的敏感性最高(LC50分别为0.191 2和0.041 4 μg/mL)，伊宁市、乌鲁木齐市种群对溴氰虫酰胺的抗性倍数分别为15.26、3.53倍，为中等水平抗性和敏感性降低，泽普种群表现敏感；伊宁市和泽普县种群对亮泰为敏感性降低和中等水平抗性，其抗性倍数分别为4.38和13.48倍，乌鲁木齐市种群保持敏感(RR2.15倍)。

2019年与敏感种群JZ-S相比，各田间种群对阿立卡都保持敏感，而对溴氰虫酰胺都产生了不同水平的抗性，其中疏勒种群为敏感性降低，乌鲁木齐和伊宁种群都发展了低到高水平抗性，昌吉种群达到极高水平抗性，抗性倍数分别为3.61、8.14、96.49和1 429.34 倍。表3

表3 新疆不同地区玉米螟对常用杀虫剂的抗性水平Table 3 Resistance to commonly used insecticide of Ostriniafurnacalis populations in Xinjiang using artificial diet-dipping method

2.2 新疆不同玉米螟种群鱼尼丁受体表达量

研究表明，2018年采集的玉米螟各种群的鱼尼丁受体基因OfRyR相对表达量之间无显著差异(图1A)；而2019年各种群的OfRyR表达量之间有明显差异，其中昌吉种群(CJ)OfRyR的表达量最高，伊宁种群(YN2)的表达量次之，都显著高于敏感种群JZ-S,表达量分别是JZ-S的4.04和3.85倍；乌鲁木齐(UQ)和疏勒(SL2)种群的表达量最低，且与JZ-S无显著差异(图1B)。图1

注：图中数据为平均数±标准误，不同的字母表示差异显著(P<0.05)Note:Data are mean±SE.Different letters indicate significant difference at P<0.05 level图1 2018和2019年新疆玉米螟不同种群的鱼尼丁受体表达量Fig.1 Relative expression of ryanodine receptor in different populations of Ostriniafurnacalis from Xinjiang in 2018(A)and 2019(B)

2.3 新疆不同玉米螟种群鱼尼丁受体基因突变检测

研究表明，测试种群OfRyR的第1 339、4 534、4 733及4 890位点(分别对应于小菜蛾PxRyR的E1338D、Q4594L、I4790M和G4946E突变位点)都未检测到氨基酸替换。图2

3 讨 论

害虫抗药性监测是指导田间杀虫剂正确合理使用的基础，其既可筛选有效的替代药剂，也为抗性机理的研究与分析提供理论依据[19]。2018年抗性监测结果显示，乌鲁木齐种群除了对溴氰虫酰胺敏感性降低(RR为3.53倍)，对其它测试杀虫剂均为敏感，疏勒种群对氯虫苯甲酰胺的敏感性下降(RR为4.00倍)；伊宁种群对溴氰虫酰胺和阿立卡产生中等抗性，对亮泰为敏感性降低(RR分别为15.26、14.10和4.38倍)；疏勒种群对阿立卡达到中等水平抗性(RR为20.17倍)；泽普种群对阿立卡和亮泰都产生中等水平抗性，抗性倍数分别为10.97和13.48倍。2019年新疆4个地区的玉米螟抗性测定结果显示，伊宁、昌吉种群已对溴氰虫酰胺产生了高至极高水平的抗性，抗性倍数最高达1 429倍。害虫对常用杀虫剂敏感性下降、产生抗性的速度和幅度与药剂的持续选择压力有关。通过玉米螟采集地施药情况调查发现，乌鲁木齐地区主要以生物防治为主，对多数药剂表现较高的敏感性，而疏勒、泽普种群防治以双酰胺类或双酰胺类复配剂为主，伊宁、昌吉地区防治玉米螟则以双酰胺类药剂氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺、拟除虫菊酯类药剂为主，由于这些地区使用双酰胺类药剂的频次较高，较高选择压造成当地玉米螟对氯虫苯甲酰胺及其复配剂以及溴氰虫酰胺敏感性降低至产生高水平抗性。研究表明，番茄斑潜蝇、斜纹夜蛾、小菜蛾和二化螟对溴氰虫酰胺和氯虫苯甲酰胺存在明显的交互抗性[10,20-22]。研究调查发现，各地区防治玉米螟施用溴氰虫酰胺较少，则当地种群对该药剂的高水平抗性是否源于氯虫苯甲酰胺或者其他药剂的交互抗性有待调查确定。由此可以看出，如何减缓新疆玉米螟对双酰胺类药剂尤其是溴氰虫酰胺的抗性已成为亟需解决的问题，在今后的的玉米螟防治中注意合理用药，尽量避免在高龄或成虫期用药，轮换使用作用机制不同的杀虫剂，并开展相关的持续的抗性监测及治理工作。

在连续2年监测玉米螟对常用杀虫剂的抗性水平时，发现新疆玉米螟对双酰胺类杀虫剂及其复配剂都有不同程度的抗性，且其致死中浓度也存在较大的波动性，玉米螟对常用杀虫剂的田间抗性是复杂且是不稳定的。研究发现，室内选育的玫瑰色卷蛾抗氯虫苯甲酰胺品系抗性不稳定，停止筛选5代后敏感性就恢复到选育前的水平[23]；对氯虫苯甲酰胺具极高水平抗性的田间小菜蛾种群(2 040倍)在室内不接触药剂饲养7代其抗性降低至25倍[9]。通过轮换药剂使用、减低杀虫剂使用频次等科学合理的治理策略，是能够延缓玉米螟对双酰胺类药剂的抗性发展并延长杀虫剂的使用寿命。

许多研究已经证实，靶标抗性是害虫对双酰胺类药剂产生抗性的重要机制，其中鱼尼丁受体基因表达量的变化是抗性机制之一，研究表明，害虫抗性种群的鱼尼丁受体基因表达量显著升高。孙丽娜等[14]研究发现，对氯虫苯甲酰胺具中等水平抗性的小菜蛾种群鱼尼丁受体mRNA表达量相对于敏感品系显著提高(5.79倍)；邓放等[24]研究发现，氯虫苯甲酰胺可诱导菜青虫鱼尼丁受体mRNA的表达水平，抗性菜青虫种群(36.3倍)鱼尼丁受体mRNA的表达量是敏感种群的6.32倍；王少丽等[15]用氯虫苯甲酰胺连续筛选甜菜夜蛾31代，得到105.6倍的抗性品系，定量PCR结果表明，抗性品系1、2和4龄幼虫的鱼尼丁受体基因表达量显著增加，分别为敏感种群的5.99、2.79和2.14倍，一方面表明鱼尼丁受体表达量的变化与甜菜夜蛾抗性形成有关，另一方面也说明甜菜夜蛾抗药性的形成可能主要表现在幼虫阶段；Jouraku等[25]通过RNA测序比较发现对氟虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺具极高水平抗性的日本熊本县小菜蛾种群RyR的表达量是敏感品系的11.5～22.2倍。定量PCR分析结果表明，2018年新疆玉米螟不同种群的鱼尼丁受体基因的表达量之间无显著差异，测试的4个种群中仅伊宁种群对溴氰虫酰胺具中水平抗性，乌鲁木齐种群对溴氰虫酰胺及疏勒种群对氯虫苯甲酰胺都为敏感性降低；而在2019年各田间种群RyR的表达量均高于敏感种群，其中对溴氰虫酰胺产生极高水平抗性的昌吉种群RyR表达量最高，其次是具高水平抗性的伊宁种群，对溴氰虫酰胺低抗和敏感性降低的乌鲁木齐和疏勒种群的RyR表达量最低，且昌吉和伊宁种群RyR的表达量与敏感种群相比差异显著，可以看出各种群RyR表达量与其对溴氰虫酰胺的抗性水平有一定的正相关性。

害虫对双酰胺药剂抗性的另一个重要的靶标机制即鱼尼丁受体产生单点突变，目前相关研究已取得不少进展，其中多数为小菜蛾的报道。Troczka等[11]通过鱼尼丁受体序列比对首次发现泰国和菲律宾对氯虫苯甲酰胺产生高水平抗性的小菜蛾田间种群存在G4946E突变；G4946E位点位于RyR基因羧基末端的第4跨膜区与第4和第5跨膜区的胞外连接环之间，在已知的所有昆虫鱼尼丁受体中高度保守，该突变削弱了氟虫酰胺和氯虫苯甲酰胺的结合力，这一突变是导致小菜蛾对氯虫苯甲酰胺产生高水平抗性的重要原因，随即有不少相关后续报道。Guo等[12-13]通过检测发现，我国广东小菜蛾田间氯虫苯甲酰胺高抗种群也存在G4946E突变，相关性分析发现该突变频率与种群对氯虫苯甲酰胺的抗性倍数之间呈明显的正相关(R2=0.82，P=0.000 3)，对云南氯虫苯甲酰胺高抗(2 128倍)小菜蛾田间种群进行检测发现鱼尼丁受体基因新的3个突变(E1338D、Q4594L和I4790M)，且通过连锁关系分析表明，这4个突变通过不同的组合共同导致了小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性；Yao等[26]同样也发现在对氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺分别产生了77.6和42.6倍抗性的浙江余姚二化螟田间种群鱼尼丁受体中存在G4910E突变；而Lu等[27]检测发现我国东部和中部地区8个二化螟种群RyR存在G4946E，突变频率达15%～56.7%，但相关性分析发现G4946E突变频率与二化螟种群对氯虫苯甲酰胺的抗性水平之间没有显著相关性，推测还可能存在其他突变与G4946E共同承担抗性的产生；Jouraku等[25]发现在2个对氟虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺高抗的小菜蛾抗性种群RyR中存在G4946和I4790K，功能验证表明，I4790K是小菜蛾对溴氰虫酰胺产生抗性的主要因素。突变检测结果显示2019年采集的新疆玉米螟抗性种群RyR都不存在E1339D、Q4534L、I4733M和G4890E突变。可见不同虫种、不同背景下的双酰胺类药剂抗性机制是有差异的。由于不同田间种群间存在地理隔离及用药历史背景的差异，可能会由于其他药剂抗性导致的突变或者还存在其他未知的突变引起双酰胺类药剂抗性，因此，还需大量采集田间玉米螟，检测抗性种群RyR表达量的变化及其中已报道的点突变、突变频率，同时关注是否有新的突变形成，这将有助于揭示玉米螟对双酰胺类杀虫药剂的抗性演化。

4 结 论

新疆玉米螟对双酰胺类药剂的敏感性显著降低，其中2018年测定显示具有对氯虫苯甲酰胺低敏感性、对阿立卡、亮泰及溴氰虫酰胺产生中等水平抗性的田间种群，2019年采集的昌吉和伊宁种群对溴氰虫酰胺已达高水平抗性，鱼尼丁受体表达量的增加以及E1424D突变是抗性产生的重要机制。