石竹叶斑病病原鉴定

李 番，任毓忠，焦瑞莲，孙 璘，李国英

(新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学农学院，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】石竹(DianthuschinensisL.)。属多年生草本，自然花期5～9月，适应性广，喜光照充足、干燥、通风和排水良好的土壤。我国共有石竹属植物16种，其中8个为新疆特有种[1]。石竹具有很高的药用价值和经济价值[2]，石竹花色丰富，花形优美[3]。随着种植面积的不断增加，给病害的传播和扩散提供了有利条件。【前人究进展】石竹病害有30多种[4,5,6]，国内已发生的病害有：黑斑病(A.dianthi)、锈病(Uromycesdianthi)、白粉病(Erysiphebuhrii)、灰斑病(Heterosporiumechinulatum)、枯萎病(Fusariumoxysporum)、根腐疫病(Phytopathoraspp)、病毒病和黄化植原体病等。其中，叶斑病是最常见且危害严重的病害之一，引起石竹叶斑病的病原主要有两类，链格孢属(A.dianthi和A.tenuissima)和匍柄霉属(Stemphylium)。【本研究切入点】新疆关于石竹病害鲜有报道。2018年5月新疆石河子市区种植的石竹花上出现一种病害，植株叶片、茎秆和花柄上出现中间白边缘紫红色斑点，造成植株叶片干枯，甚至整株干枯死亡。该病害的病原尚不明确，难以防治。研究鉴定石竹叶斑病病原。【拟解决的关键问题】研究引起石竹病害的病原菌进行形态学观察和分子生物学特性，分析其致病菌，为该病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

2018年6月，在石河子市区种植的石竹上，采集表现明显叶斑病症状的叶子及植株带回实验室内，按照常规组织分离法[7]对病样进行分离，分离时采用PDA培养基，将分离后获得菌株进行单胞纯化，依据菌落形态特征选取8个菌株作为代表性菌株，供致病性测定和病原鉴定，分别编号为XJ-A、XJ-B、XJ-C至XJ-H，用PDA斜面4℃保存备用。

1.2 方 法

1.2.1 致病性鉴定

致病性鉴定选用的健康石竹幼苗购于石河子市苗木基地。致病性鉴定采用菌丝块贴接法和喷雾法2种方法。

1.2.1.1 菌丝块贴接法

将供试菌株于PDA培养基上进行活化培养7～8 d，用直径为5 mm无菌打孔器打取菌落边缘菌饼，将菌丝面贴于已经消毒的健康石竹叶上，每一菌株接种10片叶子，以无菌PDA培养基作为空白对照；

1.2.1.2 喷雾法接种

刮取在培养基上已大量产孢的菌落表层，双层纱布过滤后，用无菌水配置成1×106cfu/mL的孢子悬浮液进行喷雾接种，以无菌水作为空白对照，设置重复3次。接种后用透明塑料薄膜分别罩住接种后的植株为其保湿，3 d后揭掉塑料薄膜，连续观察接种植株的发病情况，对发病植株组织再进行组织分离。

1.2.2 病原菌鉴定

1.2.2.1 病菌培养特性(1)病菌在不同培养基上的生长情况

选用马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、马铃薯蔗糖培养基(PSA)、水琼脂(WA)、玉米粉琼脂培养基(CMA)和石竹叶培养基，石竹叶培养基参考胡翠凤等[8]的制作方法。将PDA上活化的XJ-H菌株，按照致病性鉴定相同方法打取菌饼，挑取菌饼分别接于5种培养基中央，28℃恒温培养，采用张建宁[9]的方法每天测量菌落直径，共测量7 d，计算菌落的日生长量并观察菌株在不同培养基上的生长状况，每个处理设置3次重复。

(2)病菌形态特征

选用5种培养基及不同的培养条件，诱发病菌分生孢子的产生。具体方法如下：将接有XJ-H菌饼的不同培养基平板置28℃恒温黑暗培养，待菌落布满整个培养皿后，采用丁成等[10]刺激链格孢产生孢子的方法，将菌落表面的菌丝刮除，并用紫外灯照射30 min，将平板分别置于18℃完全黑暗和光暗交替(光照∶黑暗=1∶1)的培养箱中，低温培养7 d，镜检观察不同培养基及不同光照处理的平板上是否产生分生孢子，并对分生孢子梗、分生孢子的形状、颜色进行观察和测量(至少测量50个)，每个处理设置3次重复，参考《中国真菌志》鉴定病原菌。

1.2.2.2 分子生物学鉴定

刮取PDA平板上28℃恒温培养7 d的菌丝，利用真菌DNA提取试剂盒进行菌株基因组DNA的提取，-20℃保存备用。选用以下3组引物进行PCR扩增，包括rDNA-ITS区域引物ITS1/ITS4、β-微管蛋白基因引物β-tubulin 2a/β-tubulin 2b，以及组蛋白3基因引物H3-1a/H3-1b。PCR扩增条件参照岳永亮[11]和刘威等[12]的方法进行，PCR扩增后产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR产物委托上海生工生物工程股份有限公司进行序列测定。将所测得序列经过校准后在NCBI的GenBank数据库进行Blast比对，并下载已登录的相似序列进行同源性分析，利用MEGA5.22软件采用邻接法(NJ)，进行多基因系统发育树的构建。表1

表1 PCR扩增的引物Table 1 Primers for PCR amplification

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离及代表菌株的选择

从采集的病样中分离了31个链格孢属菌株，依据菌落形态特征选取8个作为代表性菌株，供致病性测定和病原鉴定，分别编号为XJ-A、XJ-B、XJ-C至XJ-H。

2.2 病害症状

病害田间症状主要以危害叶片为主，也感染花朵和茎秆，通常近地面下部叶片最先发病，然后向上扩展，发病初期病斑呈圆形或椭圆形，大多病斑呈紫红色至紫黑色，部分病斑褐色(图1A)；中后期病斑中央颜色逐渐变为淡褐色，病斑逐渐扩大连接成片，叶子逐渐发黄萎蔫，最后整片叶子发白为枯稻草色(图1B)，潮湿时叶片上产生深灰色菌丝和分生孢子。侵染茎秆后，维管束被破坏，侵染部位以上便萎蔫枯死，花蕾上病斑多发生在花柄上，导致整个花蕾枯死(图1C)。图1

注：A:感病初期叶片症状；B:感病中后期叶片症状；C:花蕾枯死症状Note:A:Early leaf symptoms;B:Middle and Late leaf symptoms;C:Dead bud symptoms图1 石竹叶斑病田间症状Fig.1 Symptoms of leaf spot on the in Dianthus chinensis field

2.3 致病性鉴定

研究表明，无论是菌丝块贴接法，还是孢子悬浮液喷雾接种，8个代表菌株均能在接种3 d后叶片上出现症状，7 d后有明显的紫褐色病斑出现，病斑初期为黑褐色，周围有黄色晕圈，10～15 d病斑逐渐扩展为大病斑(图2A)，后整片叶子枯死呈稻草黄色(图2B)，与大田症状一致，对照植株表现正常(图2C)，从接种后发病的病斑上再次分离、纯化，得到相同病原菌，所选择的代表菌株为石竹叶斑病的致病菌。图2

注：A:接种植物症状；B:叶片枯死症状；C:健康植株Note:A:Symptoms of inoculated plants;B:Dead leave symptoms;C:Healthy plant图2 致病性测定Fig.2 Results of pathogenicity test

2.4 病原菌鉴定

2.4.1 病菌培养特性

研究表明，病原菌在上述5种培养基上都可生长，在石竹叶培养基上生长最快，其次是在PDA培养基、PSA培养基与CMA培养基，在WA培养基上生长最慢。病原菌在石竹叶培养基上，初期菌落为白色，后为灰色且呈轮纹状；在PSA与PDA培养基上菌落形态相似，菌落为圆形，初期正面为灰绿色，后期菌落颜色逐渐加深，呈墨绿色，菌落上菌丝转为灰白色，PDA培养基上菌落菌丝较PSA边缘菌丝浓密匍匐生长；在CMA培养基上，初期菌落为浅墨绿色，后逐渐转为黑绿色，菌落中央凸起为台状，菌丝浓密；WA上病原菌落生长缓慢，有向周围生长的白色菌丝。表2，图3

表2 不同培养基上菌落生长速率及产孢Table 2 Colonies growth rate and sporulation in different culture media

注：a～e:分别为菌株在PDA、PSA、CMA、石竹叶和WA培养基上的菌落形态Note:a-e:Colony on the medium of PDA,PSA,CMA,Dianthus chinensis leaf and WA respectively图3 不同培养基上的培养特性Fig.3 Colony of isolation in different culture media

2.4.2 病菌形态特征

供试的XJ-H菌株在刮除菌丝和紫外照射30 min刺激处理后，分别置于不同光照条件下18℃低温培养，在石竹叶、PDA、CMA和WA培养基上完全黑暗和光暗交替条件下培养均未产生分生孢子，在PSA培养基黑暗培养也未产生分生孢子，只有用PSA培养基刮除菌丝+紫外照射30 min且18℃光暗交替(光∶暗=1∶1)培养，才有大量分生孢子的产生，且分生孢子都能萌发。

菌株的分生孢子梗单生或者簇生，褐色(图4D)；分生孢子褐色、2～7个串生(图4C)，未完全成熟时分生孢子为柱形，老熟的分生孢子倒梨形或长倒棍棒形，分生孢子大小为17.25～80.37 μm×10.85～18.17 μm，有4～9个横隔，0～6个纵隔或斜隔，横隔处略溢缩，且颜色较深(图4A,B)。喙浅褐色，喙端稍膨大，喙大小为12.37～38.94 μm×2.51～5.60 μm。图4

注:A:PSA上分生孢子形态;B:发病叶片上分生孢子形态;C:串生分生孢子;D:分生孢子梗Note:A:Conidial on PSA;B:Conidial on infected leaves;C:Conidia chains;D:Conidiophores图4 石竹叶斑病病原菌形态学特征Fig.4 Morphology of in Dianthus chinensis leaf spot

2.4.3 分子生物学鉴定

研究表明，利用rDNA-ITS区、组蛋白3、β-微管蛋白基因的引物对供试菌株进行PCR扩增，获得长度分别为571、490和346 bp长度的DNA片段，利用NCBI进行Blast同源性比对，供试的8个菌株ITS区序列与A.nobili(登录号：LC4405931)和A.dianthi(登录号：AY154702)序列同源性99.65%～100%；β-tubuliny序列与A.nobilis(登录号：JQ672017)的同源性达99.42%～99.96%；组蛋白3序列与最接近的细极链格孢(登录号：KF996967)序列同源性仅为82.83%～86.94%。而细极链格孢菌的ITS区序列和β-tubuliny序列与待测菌株的同源性分别为95.28%和97.12%。由于在GenBank中没有查询到关于石竹链格孢菌的组蛋白3序列信息，将ITS区序列与β-tubuliny序列进行拼接，选择引起石竹枯萎病的镰孢菌(Fusariumoxysporumf.sp.dianthi)作为外群序列，供试的8个菌株均与A.nobilis和A.dianthi聚为同一组。图5，图6

注:A:引物ITS1/ITS4；B：引物β-tubulin2a/β-tubulin 2b；C:引物H3-1a/H3-1b.M DNA Mark；CK：阴性对照；泳道1～8：分别为供试菌株XJ-A～XJ-HNote:A:primer ITS1/ITS4;B:primer β-tubulin2a/β-tubulin2b;C:primer:H3-1a/H3-1b;M Molecular size marker，CK:Negative control;Lane:Test strain XJ-A～XJ-H图5 供试菌株 rDNA-ITS,β-tubuliny和组蛋白3基因PCR扩增Fig.5 rDNA-ITS,tub2 and H3 gene PCR amplification of A. dianthi

图6 基于ITS和β-tubuliny序列组合的系统发育树Fig.6 Phylogenetic relationships of Alternaria dianthi based on sequence ITS-tub2

3 讨 论

试验供试的XJ-H病菌的培养特性与形态特征与胡翠凤等[13]报道的香石竹叶斑病菌形态相似，鉴定为Alternariadianthi。引起石河子地区石竹叶斑病的病原为石竹链格孢菌A.dianthi，经查阅资料A.dianthi与2002年已更名为A.nobilis[14]。

链格孢属真菌广泛分布于自然界中，不仅可以危害植物，有时也会对人类造成感染，引起甲癣等疾病[15]。链格孢属中大孢子链格孢常侵染植物，引起植株叶斑病。石竹链格孢A.dianthi为链格孢属中大孢子之一，据报道引起石竹病害的链格孢属病原菌共24种，名称沿用至今的有12种，包括A.nobilis(dianthi)、A.vaccariae、A.juxtiseptata、A.subeliptica、A.diagostic等[16]，以上链格孢属真菌在生物学特征上也极为相似，只能通过观察菌体的生长和分隔模式等细节进行分类和鉴定，这就让分类变得更加复杂。利用真菌rDNA-ITS区及多种基因序列的比对和同源性分析已在植物病害病原的鉴定中普遍使用，研究将病菌形态特征的观察与多基因测序分析相结合，使得鉴定结果更加可靠。

试验过程中发现，一般田间采集的植物发病叶片都可观察到大量的分生孢子，但在PDA培养基上A.dianthi几乎不产生分生孢子，试验应用PSA培养基+刮除菌丝，同时结合紫外线照射和低温(18℃)光暗交替培养的方法，使A.dianthi产生大量分生孢子，且孢子大多数都能正常发芽，表明了伤害胁迫处理、紫外照射和变温培养等方法能成功诱导该病菌产孢[17]。另外，试验中也发现，发病叶片上收集的分生孢子与诱发培养的在形态上存在一定的差异，这可能与病菌生长的营养条件和环境条件差异相关。据报道，田间病残体和带病植株是初侵染的主要来源，病害随带病幼苗调运进行远距离传播，田间分生孢子主要借风雨传播和侵染，并且叶斑病常发生于近地面植物叶片，在新抽出的叶子中较少[18]。在病害的控制上，可通过清洁田园中植株病残体、轮作、早期药剂防治、植物检疫，对于发病较轻的植株可摘去基部叶片等措施进行病害的防控。

与A.dianthi发病症状相似的有Heterosporiumechinulatum[19]，2种病害的相同点是2种病害均可以感染石竹属植物，形成叶斑。不同点A.dianthi可引起石竹属植物叶斑病，潜伏期3 d左右，温度达到15～25℃时被感染植株出现症状；Heterosporiumechinulatum仅寄生石竹属中部分植物，潜伏期1周左右，出现感病症状的温度低于A.dianthi。2种病害通常不易区分，因此，除借助分子学手段，田间可通过病害发生的时间和温度等来辅助病害种类的诊断。镰刀菌引起的萎蔫病也是石竹上的破坏性病害[20]，发病时间相近，因此，在病害防治时因注意通防统治，避免病害发生连续不断，造成经济损失。

4 结 论

供试菌株均有致病性。将供试菌株ITS区与β-tubulin序列进行比对分析，其序列与A.nobilis序列的同源性均高达99%以上，ITS-β-tubulin建立的多基因联合系统发育树显示，8个致病菌株与A.dianthi和A.nobilis聚在1个组，A.dianthi和A.nobilis为同种异名。结合形态学观察与ITS-β-tubulin建立的多基因联合系统发育树分析，引起石河子地区石竹叶斑病的主要病原为Alternariadianthi(nobilis)。