盐穗木叶片及根际土壤微生物群落高通量分析

迪拉热·海米提，樊永红，王伟楠，喻文丽，艾海白尔·卡斯木

(新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046)

0 引 言

【研究意义】根际土壤微生物是一类能够直接影响植物根系的土壤范围内生长繁殖的微生物，其与植物根系相互作用，在维系根系的生态平衡的同时也担负着根际重要的生理过程[1]，主要参与土壤与植物之间进行的物质交换有多种功能[2]。根际微生物也被称为植物体的“第二套基因组”[3]。植物能通过一些有益的根际微生物获得某些特定的功能，同时释放部分光合作用所产生的碳，为这些微生物提供所需的生存能量和物质基础[4]。【前人研究进展】根际微生物对植物的作用主要体现在提高植物从环境中获取营养物质的能力[5]，通过激素合成或者降解调控植物的生长能力和适应环境的能力[6]，通过与致病菌相互作用诱导植物产生抗性，启动免疫调控[7]。在正常条件下，植物根系与土壤及根际微生物所形成的根际微生态圈会维持着一种动态平衡。植物内生菌是指植物组织内的微生物，也被学者定义为在其生活史中的某一段时期生活在植物体内并且对植物组织没有造成伤害的菌[8]。有一些内生菌能够促进植物种子萌发、光合形态建成、增强宿主植物抗逆性[9]。盐穗木是分布于中国西北新疆塔里木盆地、焉耆盆地和吐鲁番盆地的藜科多年生灌木，是一种极端耐盐植物也是盐生荒漠的主要建群植物，具有抗干旱、耐盐碱、耐风蚀沙埋的特点[10-11]。【本研究切入点】高通量测序作为一个有效研究微生物群落结构的手段，提取微生物总DNA进行测序和比较广泛应用于微生物学领域中。研究盐穗木根际土壤中以及叶片内的微生物群落结构及其多样性。【拟解决的关键问题】采用高通量测序技术，研究新疆盐碱环境中，极端耐盐植物盐穗木的根际土壤及叶片内生微生物群落组成和结构，盐穗木植株体内和其生长的盐碱化土壤环境中微生物所表现的功能、资源的开发利用和生物菌肥的制作等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

所用盐穗木根际土壤及其叶片样本采自新疆五家渠市103团的盐碱地。

1.2 方 法

1.2.1 盐穗木叶片及根际土壤

采用剥落法和铲除法，收集盐穗木根际土壤及其叶片各3份，分别命名为盐穗木根际土壤样品(YS1、YS2、YS3)，盐穗木叶片样本(YP1、YP2、YP3)采自同一生境下的不同植株。首先选出生长正常的植株，用小铁铲轻轻铲土直至植物根，收集附着在根上0～4 mm的土作为根际土，收集适量盐穗木叶片。将土样及叶片收集物中的杂质去除后，装入密封袋后带回实验室，置于-20℃冰箱中，备用。

1.2.2 高通量测序

采用SDS方法对样本的基因组DNA进行提取，使用带Barcode的特异引物和高效高保真酶进行PCR。引物对应区域分别为：16S V4区引物(515F和806R)：鉴定细菌多样性；18S V4区引物(528F和706R)：鉴定真核微生物多样性；ITS1区引物(ITS5-1737F和ITS2-2043R)：鉴定真菌多样性。使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量并使用NovaSeq6000进行上机测序。

1.2.3 生物信息学

根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，使用FLASH[12]对每个样本的reads进行拼接，过滤处理[13]得到高质量的Tags数据。参照Qiime[14]的Tags质量控制流程，Tags序列通过[15]与物种注释数据库进行比对去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。利用Uparse软件[16]对所有样本以97%的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units)。对OTUs序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA132[17]的SSUrRNA数据库[18]进行物种注释分析，获得分类学信息并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成。

1.3 数据处理

使用MUSCLE[19]软件进行比对并且得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。使用Qiime软件计算Alpha多样性指数，使用R软件绘制稀释曲线，物种累积曲线并使用R软件进行Alpha多样性指数组间差异分析。用Qiime软件计算Unifrac距离、构建UPGMA样本聚类，使用R软件绘制PCoA图。

2 结果与分析

2.1 盐穗木根际土壤微生物群落多样性

2.1.1 测序数据的质控

研究表明，盐穗木土壤样品YS1、YS2、YS3最终用于后续分析的有效序列分别有60 488、63 755、54 921。对所有样本的有效序列，以97%的一致性(Identity)进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类，然后对OTUs的序列进行物种注释。盐穗木根际土壤样品YS1、YS2、YS3的细菌OUT数分别为1 401、1 341、1 262。相对应的文库覆盖率分别为99.7%、99.7%、99.8%，真菌OUT数分别为375、413、277，相对应的文库覆盖率分别为100%、99%、99%。物种丰度稀释曲线上升到一定高度后趋于平稳，测序的深度已足够代表样品中大多数细菌与真菌种类。表1～2，图1～2

ACE指数1 213.322～1 368.982，ACE和Chao1越大，群落的丰富度越高，Chao1指数为1 183.266～1 368.077。Shannon指数和Simpson指数是用来估算菌群多样性的指数，Shannaon值越大，菌群多样性越高。3个盐穗木根际土壤样品的Shannon指数为7.161～8.132，Simpson指数为0.965～0.991。其中YS1的Shannon指数(8.132)，Simpson指数(0.991)，chao1(1 368.007)，ACE(1 368.982)高于其它2个样品，其细菌群落多样性和丰富度比其余2个样品较高。对3个盐穗木根际土壤样品YS1、YS2、YS3真菌群落分析中ACE指数263.863～418.376，Chao1指数258.857～412.000，3个盐穗木根际土壤样品YS1、YS2、YS3的Shannon指数为2.571～4.817，Simpson指数为0.670～0.927。其中YS1的Shannon指数(4.817)，Simpson指数(0.927)，高于其它2个样品，其真菌群落多样性比其余2个样品较高。表1～2

表1 盐穗木根际土壤样品细菌OTUs丰度和α多样性指数Table 1 OTUs composition and α-diversity index of bacterial community of Halostachys caspica rhizosphere soil

表2 盐穗木根际土壤样品真菌OTUs丰度和α多样性指数Table 2 OTUs composition and α-diversity index of fungus community of Halostachys caspica rhizosphere soil

图1 盐穗木根际细菌物种丰度稀释曲线Fig.1 Rare faction curve of bacterial communityof Halostachys caspica rhizosphere soil

图2 盐穗木根际真菌物种丰度稀释曲线Fig.2 Rare faction curve of fungus communityof Halostachys caspica rhizosphere soil

2.1.2 不同盐穗木根际细菌和真菌OTUs分布

研究表明，占文库总OTUs的38.79%，不同盐穗木根际细菌群落的种类组成差异大，其中YS1特有的OUT数最多，即其细菌群落组成多样性较其它2个样品高。3株盐穗木根际土壤样品之间共有的真菌OTUs个数为124，即有124个真菌OTUs在3个盐穗木根际土壤样品中均有分布，YS1、YS2、YS3分别有119、142、68个特有OTUs，YS2真菌多样性最高，YS1和YS3拥有的相同菌群种类，两者种类组成差异大。图3～4

图3 盐穗木根际细菌OTUs分布韦恩图Fig.3 Venn graph of bacterial OTUs in Halostachys caspica rhizosphere soil

图4 盐穗木根际真菌OTUs分布Fig.4 Venn graph of fungus OTUs in Halostachys caspica rhizosphere soil

2.1.3 不同盐穗木根际细菌和真菌多样性

研究表明，盐穗木根际土壤样品YS1中放线菌门(Actinobacteria)丰度最高，为34.21%。其次为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)相对丰度分别为23.94%、14.9%、9.6%、7.3%、4.4%、2%、0.9%、0.8%。在YS2中变形菌门丰度最高，为36.83%。其次为放线菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、疣微菌门、厚壁菌门相对丰度分别为17.97%、15.71%、10.02%、6.23%、5.3%、2.9%、1.5%、0.4%。YS3中芽单胞菌门丰度最高，为32.77%。其次为变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、疣微菌门、厚壁菌门，相对丰度分别为28.38%、13.44%、10.36%、4.02%、3.77%、2.97%、0.68%、0.25%。盐穗木根际土壤YS1、YS2、YS3中真菌的优势菌群均是子囊菌门(Ascomycota)，分别占64.40%、50.04%、39.87%。其次为图中10个门之外的其他所有门之和，与数据库无法比对的。除此之外，YS1和YS2、YS3中分别有担子菌门(Basidiomycota)3.39%、13.30%、0.25%，毛霉门(Mucoromycota)0.08%、0.21%、0.02%以及极少量的被孢霉门(Mortierellomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)。图5～6

2.1.4 不同盐穗木根际细菌和真菌群落主成分

研究表明，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)对样品差异性的解释度分别为31.86%、20.66%，合计为52.52%和30.84%、21.42%，合计为52.26%，是差异的部分来源。盐穗木根际土壤样品YS2和YS3细菌群落组成相似程度高，但YS1位于PC1轴正值区域，与位于PC1负值区域的YS2、YS3偏离较大，主成分差异显著，样品的细菌群落结构发生了显著的变化。YS1的真菌群落结构与其余2个样品YS2、YS3差异较大。图7～8

图 5 盐穗木根际细菌门水平上的相对丰度Fig.5 Relative abundance in the major phyla of bacterial community composition

图6 盐穗木根际真菌门水平上的物种相对丰度Fig.6 Relative abundance in the major phyla of fungus community composition

注：红色点为盐穗木Note:Red representative Halostachys caspica图7 盐穗木根际细菌群落PCoAFig.7 Principal component analysis of bacterial community in Halostachys caspica rhizosphere soil

注：红色点为盐穗木Note:Red representative Halostachys caspica图8 盐穗木根际真菌群落PCoAFig.8 Principal component analysis of bacterial community in Halostachys caspica rhizosphere soil

2.2 盐穗木叶片内生微生物群落多样性

2.2.1 测序数据的质控

研究表明，盐穗木叶片样品YP1、YP2、YP3最终用于后续细菌多样性分析的有效序列分别有67 602、63 071、50 157。真菌多样性分析产生的有效序列分别有60 201、62 886、63 555。对其进行OTUs聚类，然后对OTUs的序列进行物种注释。盐穗木叶片样品YS1、YS2、YS3的细菌OUT数分别为181、165、354。相对应的文库覆盖率分别为99.7%、99.7%、99.8%，真菌OUT数分别为38、39、230，相对应的文库覆盖率均为100%。物种丰度稀释曲线，上升到一定高度后趋于平稳，测序的深度已足够，可以代表样品中大多数细菌与真菌种类。其中，YP3的细菌和真菌种类多样性显著高于其余2个样品。表3～4，图9～10

ACE指数为196.210～349.602，Chao1指数为1 183.266～1 368.077。ACE和Chao1越大，群落的丰富度越高。Shannon指数和Simpson指数是用来估算菌群多样性的指数，Shannaon值越大，菌群多样性越高。3个叶片样品的shannon指数为1.612～4.942，Simpson指数为0.462～0.904。其中YP3的shannon指数，simpson指数，chao1(1 368.007)高于其它2个样品，说明其细菌群落多样性和丰富度比其余2个样品较高。对3个盐穗木叶片样品YP1、YP2、YP3真菌群落分析中，各样品的shannon指数为0.634～1.383，Simpson指数为0.228～0.353。其中YP3的shannon指数(1.383)，simpson指数(0.353)，高于其它2个样品。表3～4

表3 盐穗木叶片内生细菌OTUs丰度和α多样性指数Table 3 OTUs composition and α-diversity index of bacterial community of Halostachys caspica leaves

表4 盐穗木叶片内生真菌OTUs丰度和α多样性指数Table 4 OTUs composition and α-diversity index of fungus community of Halostachys caspica leaves

图9 盐穗木叶片内生细菌物种丰度稀释曲线Fig.9 Rare faction curve of bacterial community of Halostachys caspica leaves

图10 盐穗木叶片内生真菌物种丰度稀释曲线Fig.10 Rare faction curve of fungus community of Halostachys caspica leaves

2.2.2 不同盐穗木叶片细菌和真菌OTUs分布

研究表明，3株盐穗木叶片样品之间共有的OTUs个数为54。有54个OUT在3个盐穗木叶片样本中均有分布，仅占文库总OTUs的9.10%，不同盐穗木叶片样本内生细菌的种类组成差异大；其中YP3特有的OTUs个数为221，YP3较YP1、YP2差异较大，YP1、YP2特有的OTUs个数少，种类组成较为接近。真菌多样性分析中有24个OUT在3个盐穗木叶片样本中均有分布，仅占文库总OTUs的7.8%，不同盐穗木叶片样本内生真菌的种类组成差异大；其中YP3特有的OTUs个数为194，YP3较YP1、YP2差异较大，YP1、YP2特有的OTUs个数少，种类组成较为接近。图11～12

图11 盐穗木叶片内生细菌OTUs分布韦恩图Fig.11 Venn graph of bacterial OTUs of Halostachys caspica leaves

图12 盐穗木叶片内生真菌OTUs分布韦恩图Fig.12 Venn graph of fungus OTUs of Halostachys caspica leaves

2.2.3 不同盐穗木叶片内生细菌和真菌多样性

研究表明，在YP1中蓝细菌门(Cyanobacteria)丰度最高，丰度为98.43%，其次为变形菌门(Proteobacteria),放线菌门(Actinobacteria)，硬壁菌门(Firmicutes)，拟杆菌门(Bacteroidetes)，芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)，酸杆菌门(Acidobacteria)，其相对丰度分别为0.64%、0.65%、0.19%、0.03%、0.01%、0.01%。在YP2蓝细菌门丰度最高，丰度为98.82%，其次为放线菌门、变形菌门、硬壁菌门、拟杆菌门，其相对丰度分别为0.58%、0.38%、0.15%、0.04%，在YP3中蓝细菌门丰度最高，丰度为40.82%，其次为放线菌门、变形菌门、硬壁菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、德氏球菌门、酸杆菌门、绿弯菌门，其相对丰度分别为31.64%、18.73%、5.68%、1.34%、0.57%、0.49%、0.14%、0.12%。盐穗木叶片YP1、YP2的优势菌群门为子囊菌门，占比分别为65%、70%，但YP3中子囊菌门(Ascomycota)只占10%。YP2中还有占比2.5%的被孢霉门(Mortierellomycota)。盐穗木叶片内生真菌以子囊菌门为主，占比48.33%，还有0.83%的被孢霉门。盐穗木叶片内生菌中没有担子菌门(Basidiomycota)。图13～14

图13 盐穗木叶片内生细菌门水平上的相对丰度Fig.13 Relative abundance in the major phyla of bacterial community composition in Halostachys caspica leaves

图14 盐穗木叶片内生真菌门水平上的相对丰度Fig.14 Relative abundance in the major phyla of fungus community composition in Halostachys caspica leaves

2.2.4 不同盐穗木叶片内生细菌和真菌群落主成分

研究表明，盐穗木叶片样品YP1和YP2群落组成相似程度高，但YP3偏离较大。YP1和YP2的点靠的很近都位于PC1的负值区域，两者群落组成相似。YP3位于PC1的正值区域，与YP1、YP2不在同一象限，间隔较大距离，其群落组成与其它2个盐穗木叶片样本有较大差别。PCA主成分分析可以得出各样品分布在不同区域，且有的样品密集聚集，有的样品间间隔较大，主成分差异显著。图15～16

注：红色点为盐穗木Note:Red representative Halostachys caspica图15 盐穗木叶片内生细菌群落PCoAFig.15 Principal component analysis of bacterial community in Halostachys caspica leaves

注：红色点为盐穗木Note:Red representative Halostachys caspica图16 盐穗木叶片内生真菌群落PCoAFig.16 Principal component analysis of fungus community in Halostachys caspica leaves

3 讨 论

基于Illumina NovaSeq 测序平台对该文库进行双末端测序。经过序列的拼接过滤，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类，可以进行物种注释及丰度分析；通过α多样性(Alpha Diversity)和β多样性分析(Beta Diversity)，不仅可以揭示出样本中物种组成和样本间群落结构的差异，而且还可以进行个性化分析和深度的数据挖掘。在实验中，相同生长环境下不同的盐穗木根际土壤中的微生物群落也存在差异，造成这种差异的原因主要是土壤类型，植物残体和根系分泌物及土壤理化性质等因素[20]。而内生菌的多样性与植物种类、季节以及生长的地理环境等因素有密切的关系[21-22]。研究表明，在门水平上根际土壤细菌群落中的优势菌门为放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)等。放线菌是植物根际一类重要的微生物，在促进植物生长和防治病害等方面发挥重要作用[23]。根际盐穗木真菌群落中的优势菌门为子囊菌门。盐穗木根际土壤1号样品YS1的细菌和真菌群落多样性明显高于其余2个样品。在门水平下，盐穗木叶片内生细菌群落中的优势菌门为蓝细菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)；内生真菌群落中的优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)。有研究表明，变形菌门能够在根际土壤中成为优势菌门是因为它们增长的速度很快，在研究中盐穗木根际土壤中检测到的酸杆菌门由于生长所需的营养物质基本保持不变或者很少，所以是较为稳定的微生物组分[24-25]。蓝细菌分布极广，普遍生长在淡水、海水和土壤中，并且在极端环境(如温泉、盐湖、贫瘠的土壤、岩石表面或风化壳中以及植物树干等)中也能生长。许多蓝细菌类群具有固氮能力。从本次高通量分析结果中可以看出，盐穗木根际土壤中的微生物种群丰度是高于叶片内生微生物种群丰度的。基于第二代高通量测序技术探索盐穗木根际及叶片内生微生物种群分布特征和多样性特点并探究与其在干旱、盐碱地生境下的抗逆性之间是否存在相关性，为利用有益微生物对宿主的特性进行改变，为利用根际促生菌制作生物菌肥提供科学依据。

4 结 论

物种丰度稀释曲线上升到一定高度后趋于平稳，测序的深度已足够，可以代表样品中大多数细菌与真菌种类。其真菌群落多样性比其余2个样品较高。YS2真菌多样性最高，YS1和YS3拥有的相同菌群种类最少两者种类真菌种类组成差异大。YS1的真菌群落结构与其余2个样品YS2、YS3差异较大。其真菌群落多样性比其余2个样品高。样品的细菌群落结构发生了显著的变化，这种群落结构的差异来源可能是植物本身及其根系分泌物的差异。