补喂L-瓜氨酸对种公马精液品质、精清和血浆抗氧化能力的影响

李晓斌，赵国栋，李 海，马 晨，李凤鸣，臧长江，黄新新，李佳豪，许晓宝，马玉辉，徐文慧

(1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；2.昭苏县畜牧兽医站，新疆昭苏 835699)

0 引 言

【研究意义】L-瓜氨酸是机体氮素循环的重要参与者和中间代谢产物[1]，可从西瓜中分离获取[2]。L-瓜氨酸可由成年动物的肠道合成，主要用于肾脏合成精氨酸，以满足机体对精氨酸的需求[3]。瓜氨酸合成精氨酸需要小肠特殊的酶参与完成，即这个反应只能在小肠部位发生，因此，它在一些哺乳动物精氨酸的内源性合成中起重要作用[4]。L-瓜氨酸作为精氨酸的前体物质，通过代谢被小肠吸收，转运至肾脏合成精氨酸，进一步调控机体及血浆精氨酸的水平。【前人研究进展】彭建平等[5]给雄性SD大鼠口服4.5 g/kg BW L-瓜氨酸，发现大鼠阴茎神经海绵体内压、一氧化氮和一氧化氮合酶显著提高，对于大鼠阴茎勃起具有增强作用。缑灵山等[6]研究不同剂量的L-瓜氨酸对大鼠胃缺血再灌注损伤保护作用，L-瓜氨酸能够维持SOD的活力，降低MDA的生成。【本研究切入点】精液中活性氧主要由白细胞和未成熟的精子产生，直接影响精液的品质和抗氧化能力。当前对于配种期种公马精液品质及抗氧化的研究主要集中在冻精及细管精液方面，而提高种公马精液品质和抗氧化能力的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】以配种期种公马为研究对象，研究补喂L-瓜氨酸，在精液品质和抗氧化方面的作用，为种公马繁殖性能的营养调控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 马匹

试验选择12匹年龄5～8岁的种公马，平均采精量为(59.34±5.23)mL，平均体重为(532.34±49.14)kg。

1.1.2 精液

于试验0、10、20及30 d 每天08:00通过人工采精法采集公马精液，测量采精量，将采集的精液平均分为2份，1份鲜精用于精液品质检测，另1份鲜精离心分离精子和精清，取精清于-20℃冷冻保存，待测。

1.1.3 血液

于试验0、10、20及30 d 早晨空腹颈部静脉采集种公马血液于肝素钠抗凝管内，3 500转/min 离心15 min，取上清液，-20℃冷冻保存，待测。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

将12匹种公马随机分为试验组和对照组2组，每组6匹。在相同的运动训练及饲养管理条件下，饲喂相同营养水平的日粮。在此基础上，试验组马匹每天补喂20 g L-瓜氨酸，将每天的L-瓜氨酸与精料补充料混合补喂。进行为期30 d的饲喂试验，分别于试验开始的前1 d(即为0 d)、10、20及30 d采集马匹精液和血液，并测定相关指标。

1.2.2 饲养管理

所有试验马匹在相同条件下饲养，粗饲料(苜蓿和混合牧草)和精料补充料组成及营养水平一致，粗饲料自由采食，精料补充料4 kg/d ·匹，每匹马投喂500 g/d胡萝卜。所有马匹进行0.5 h/d的打圈运动。表1

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 精液品质

分别测定采精量，使用OLYMPUS显微镜和Equine Motility软件检测鲜精精液品质，包括活精子数(Motile,%)、精子密度(sperm density,108/mL)、直线运动率(progressive,%)、运动速度(VA,um/s)及快速运动比例(Rapid,%)。精子畸形率、精子质膜完整性和精子顶体完整性参考王捷等[7]和徐文慧等[8]检测的方法。

1.2.3.2 抗氧化指标

血浆和精清中抗氧化指标过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、抑制羟自由基能力(Inhibition to hydroxyl radical)、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)均委托南京建成生物工程研究所采用试剂盒测定。

1.3 数据处理

数据用Excel整理，使用SAS8.0中Mixed混合模型统计，固定效应有处理、采样时间及二者之间的交互作用。方差结构采用CS，数据为最小二乘平均值，显著性判断标准为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 补喂L-瓜氨酸对种公马精液品质的影响

研究表明，给种公马补喂L-瓜氨酸能够极显著提高采精量、精子直线运动率及精子质膜完整性(P<0.01)，与对照组相比较分别提高了28.08%、19.12%和36.18%；与对照组相比，活精子数、精子密度、运动速度和快速运动比例无显著性差异(P>0.05)，但比对照组分别提高了1.82%、6.99%、5.56%和14.54%；此外，试验组精子畸形率比对照组低了23.02%(P>0.05)，精子顶体完整性比对照组高了8.78%(P>0.05)。表2

表2 试验期30 d补喂L-瓜氨酸下种公马精液品质变化Table 2 Effects of supplemental L-citrulline on semen quality of stallion for 30 days

2.2 补喂L-瓜氨酸对种公马精清抗氧化能力的影响

研究表明，补喂L-瓜氨酸可以极显著提高公马精液SOD的活力和抑制羟自由基的能力(P<0.01)，分别比对照组提高了29.10%和29.87%；显著提高了种公马精液GSH-PX的活力(P<0.05)，分别比对照组高28.15%；极显著降低了精液MDA的浓度(P<0.01)，比对照组低43.43%；对于CAT活力无显著性影响；NO浓度比对照组显著提高了22.41%(P<0.05)。表3

表3 试验期30 d补喂L-瓜氨酸下种公马精清抗氧化能力变化Table 3 Effects of supplemental L-citrulline on antioxidant capacity of seminal plasma of stallion for 30 days

2.3 补喂L-瓜氨酸对种公马血浆抗氧化能力的影响

研究表明，补喂L-瓜氨酸可极显著提高公马血浆CAT、GSH-PX的活力和T-AOC、抑制羟自由基的能力(P<0.01)，分别比对照组提高了50.48%、65.75%、26.32%和20.61%；极显著降低了血浆MDA的浓度，降低了31.19%(P<0.01)；对于血浆SOD活力无显著性影响。血浆NO的浓度比对照组显著提高了14.44%(P<0.05)。表4

表4 试验期30 d补喂L-瓜氨酸下种公马血浆抗氧化能力变化Table 4 Effects of supplemental L-citrulline on plasma antioxidant capacity of stallion for 30 days

3 讨 论

提高种公马的射精量和精液品质，是满足配种需求和品种改良的保障[9]。Bem等[10]研究指出，种公马的性欲是影响其射精量和精液品质的直接因素。研究显示[11-12]，在种公畜日粮中添加VE、小肽均能够显著提高公畜的精液品质及精子活力。任波等[13]研究结果显示，在相同营养水平日粮条件下添加赖氨酸∶苏氨酸∶色氨酸∶精氨酸分别为100∶76∶40∶120能够显著提高种公猪精子顶体完整率、有效精子数目、总精子数目及精子活力。试验中，给种公马补喂L-瓜氨酸能够显著提高采精量和精子直线运动率，L-瓜氨酸对公马精子的生成和精子活力有显著作用。这与赵国栋等[14]在小鼠上的研究结果一致，其研究显示，给雄性小鼠补喂不同剂量的L-瓜氨酸与对照组相比均能显著或者极显著提高精子密度、直线运动精子数和精子活力，极显著降低畸形精子数。

试验中L-瓜氨酸能够提高公马采精量和直线运动率可能与L-瓜氨酸代谢合成精氨酸和NO有关[15-16]，但是在改善射精量和精液品质中L-瓜氨酸通过何种路径调控的，需进一步深入研究。

研究显示，活性氧是导致精子活力下降的直接因素之一[17]。精细胞内氧化剂和抗氧化剂之间的平衡遭到破坏是精细胞损伤的主要原因，可引起DNA 碱基断裂、蛋白质氧化、脂质过氧化以及遗传物质缺失[18]。前列腺和精囊腺是白细胞的主要产生组织，中性粒细胞和巨噬细胞与活性氧的产生有直接的关系，而精液中的活性氧主要来源于白细胞和未成熟的精子[19]。精液中含有少量的活性氧是机体正常的生理现象，正常水平的活性氧对精子活力有显著促进作用，特别是在激活精子获能、顶体反应以及受精的整个过程。当活性氧大量存在时，超过了抗氧化系统的清除能力及精核独特紧密结构的防御能力时，氧化应激产生，精子自身对氧化应激损伤修复能力缺乏，对精子造成不可修复的损伤[20]。

试验补喂L-瓜氨酸能够极显著提高精清SOD活力和抑制羟自由基的能力，显著提高GSH-PX的活力，又显著降低MDA的浓度，说明L-瓜氨酸对精子抗氧化能力有显著的提高作用，与补喂组精子直线运动率显著高于对照组的结果一致。血浆结果显示，补喂L-瓜氨酸能够极显著提高血浆CAT、GSH-PX的活力和T-AOC、抑制羟自由基的能力，又显著降低MDA的浓度，这与精子活力、精子直线运动率、精清抗氧能力显著提高的结果一致，L-瓜氨酸能够提高机体的抗氧化能力，与缑灵山等[6]在大鼠上的研究结果一致。试验结果显示，血浆和精清中抗氧化酶活力和总抗氧化能力变化的趋势一致，血浆中抗氧化酶及相关指标升高时，反映于精清中的相关指标呈升高趋势。血浆游离物质的水平在一定程度上能够反映机体组织或者器官相应物质的水平和浓度。瓜氨酸在机体内可转化为精氨酸 代谢，Elhattabd等[21]研究表明，给大鼠补喂L-精氨酸大鼠血清CAT活性，NO水平和T-AOC能力。研究显示，瓜氨酸对脓毒症早期大鼠肝损伤具有显著的保护作用，用瓜氨酸处理能够显著提高肝脏SOD活力，降低MDA水平[22]。L-瓜氨酸的补喂增加了机体精氨酸浓度，可能是提高精清和血浆抗氧化能力的路径之一[23-24]。L-瓜氨酸具有清除自由基，提高抗氧化能力的作用[25-26]，但是清除自由基的路径有待于进一步研究。

4 结 论

给配种期种公马补喂20 g/d的L-瓜氨酸采精量和精子直线运动率极显著提高了28.08%和19.12%；精清SOD的活力和抑制羟自由基的能力极显著提高了29.10%和29.87%；血浆CAT、GSH-PX的活力和T-AOC、抑制羟自由基的能力极显著提高了50.48%、65.75%、26.32%和20.61%。给种公马补喂L-瓜氨酸能够改善种公马精液品，提高机体抗氧化能力。