放牧与舍饲条件下夏洛莱牛肠道微生物多样性及差异分析

时间：2024-05-25

张星星，黄新，韩猛立，蒋烈戈，张倩，高攀，刘鹏，吴桐忠，钟发刚

(1.省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院畜牧兽医研究所新疆石河子 832000;2.新疆生产建设兵团第九师农业(畜牧)科学研究所，新疆额敏 834600)

0 引言

【研究意义】夏洛莱牛生长快、肉量多、体型大、耐粗放[1]。中国的夏洛莱牛主要分布在辽宁、河南和新疆塔城地区，其中新疆塔城是中国最早引入夏洛莱牛的地区，目前有舍饲和放牧2种饲养方式，放牧的夏洛莱牛主要在准噶尔盆地塔城-额敏盆地周缘诸山地的天然草地上放牧，天然草地类型分布从平原至高山分别是温性荒漠类、温性草原化荒漠类、温性荒漠草原类、温性草原类、温性草旬草原类和山地草旬类，草地整体草群质量较好，优良牧草种类多，主要以禾本科草和杂草类为主[2]。肠道作为微生物大量存在的栖息地，不仅形成了复杂的肠道微生态系统[3]，而且作为宿主生命活动的有机组成部分，对宿主的生长发育具有重要的影响[4,5]，肠道微生物与生物体物质代谢、能量流动、信号传导等有重要的调控作用，并且对动物的饮食、营养、免疫、神经调节以及慢性疾病的产生有重要的影响。【前人研究进展】健康平衡的肠道菌群的结构会促进生物体的生长发育，失衡的肠道菌群则会因为对生物体的调节发生紊乱。对肠道微生物进行深入细致的研究是理解各种慢性疾病及免疫与病原微生物疾病发生机理的重要的方式方法，并且可以对生物体在不同生境分布下的适应性机制有更深刻的理解和把握[9]。【本研究切入点】随着高通量测序技术的逐渐发展，16S rRNA在微生物基因组的研究作用中受到越来越多的重视[13]，其具有无需分离培养细菌、客观还原菌群结构和测序深度高等优势[14]。研究高通量测序技术比较放牧与舍饲条件下，夏洛莱牛肠道微生物多样性及差异。【拟解决的关键问题】以塔城地区夏洛莱牛为对象，采用HiSeq高通量测序技术，研究放牧夏洛莱牛和舍饲夏洛莱牛肠道菌群多样性及菌群结构差异。

1 材料与方法

1.1 材料

实验牛场为规模化舍饲肉牛养殖场和放牧肉牛养殖场，位于新疆塔城地区，2017年9月，选取舍饲的健康夏洛莱青年牛和自然放牧饲养的健康夏洛莱青年牛各5头牛作为试验牛，采集试验牛直肠粪便牛装入无菌封口聚乙烯袋做好标记，带回实验室。全放牧夏洛莱牛饲料为天然牧草(以禾本科草和杂类草为主)，舍饲牛饲料(精料∶干草∶青储饲料=1∶1∶5，干草为禾草饲草，精料原料为玉米、棉籽粕等)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与检测

使用粪便基因组提取试剂盒(TIANamp Stool DNA Kit)(天根DP328，中国)按照试剂盒说明书提取牛粪便样品中基因组DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA完整性，使用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计(Thermo Scientific)检测DNA样品的浓度与纯度。

1.2.2 PCR扩增与产物纯化

将提取粪便总DNA送至北京诺禾致源科技有限公司，应用Illumina HiSeq平台对细菌16SrRNA基因的V3+V4区域(341F-806R)进行扩增，引物序列为341F：CCTAYGGGRBGCASCAG；806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT，高效和高保真酶进行PCR 扩增，反应体系参照说明书，反应条件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 10 min。

1.2.3 DNA提取与检测

1.3 数据处理

对Illumina HiSeq测序的原始数据(Raw Data)进行拼接的质控，并过滤掉低质量的序列，得到有效数据(Clean Data)。基于有效数据进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类和物种分类分析；根据OTUs聚类结果，对每个OTU的代表序列做物种注释，揭示样品物种构成及丰度分布情况；对OTUs进行丰度、Alpha多样性计算、Venn图和花瓣图分析，得到样品内物种丰富度和均匀度信息、不同分组间的共有和特有OTUs信息；对OTUs进行多序列比对并构建系统发生树，通过PCoA和PCA和样品聚类树展示不同分组的群落结构差异；用LEfSe和MetaStat统计分析方法对分组样品的物种组成和群落结构进行差异显著性检验，P<0.05被认为差异显著，P<0.01被认为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 样品测序及取样深度验证

研究表明，各个样品在不同OTU中的丰度信息，10个样品共聚类为1 089个OUT，其中舍饲夏洛莱牛组1 044个OTU，放牧夏洛莱牛组1 087个OTU，平均测序读长在410～411 kb。表1

表1 10个样品测序数据统计Table 1 Sequencing data statistics of 10 samples

序列数量到3 000以后各样品稀释曲线均基本趋于平缓，此粪便样品中的物种并不会随测序数量的增加而显著增多。图1

图1 相似度为0.97 条件下各粪便样品的稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves of each stool sample at cutoff level of 3%

2.2 各样品中细菌多样性及相关性

研究表明，Chao1和Shannon指数在放牧夏洛莱牛样品中的平均值分别为1 049.57和5.44，而在舍饲夏洛莱牛样品中分别为997.23和5.39，放牧夏洛莱牛肠道中细菌多样性和丰度均高于舍饲夏洛莱牛。表2

表2 各样品细菌多样性指数Table 2 Diversity indices of bacteria in each sample

在97%的相似度水平下，得到了每个样品的OTU个数，利用R Version2.15.3软件绘出CB组和CG组的Venn图[17]，可以展示样品或组之间共有、特有OTU数目，直观的表现出样品间OTU的重合情况。结合OTU所代表的物种，可以找出不同环境中的核心微生物。10个样品共聚类为1 089个OUT，其中CB组CG组共同占有1 042个OTU，CG组特有OUT为45个，占样品总OTU数1 089的4.13%，而CB组特有OUT占样品总OTU数的0.18%。图2

注：CB.舍饲夏洛莱牛；CG.放牧夏洛莱牛Note:CB.barn feeding Charolais；CG.grazing Charolais图2 2组样品中OTUs分布韦恩图Fig.2 Venn figure of OTUs distribution of two group samples

2.3 样品群落组成

2.3.1 细菌门水平分布

研究表明，CB组有3个优势菌门(含量>1%)，CG组有2个优势菌门，厚壁菌门(Firmicutes，CB 69.3%，CG 73.8%)和拟杆菌门(Bacteroidetes，CB 27.3%，CG 22.7%)在2组中均为优势菌门，其次为疣微菌门(Verrucomicrobia，CB 1.27%，CG 0.96%)、放线菌(Actinobacteria，CB 0.35%，CG 0.83%)、广古菌门(Euryarchaeota，CB 0.73%，CG 0.21%)、变形菌门(Proteobacteria，CB 0.26%，CG 0.41%)、蓝细菌门(Cyanobacteria，CB 0.16%，CG 0.25%)、螺旋菌门(Spirochaetae，CB 0.197%，CG 0.072%)、软壁菌门(Tenericutes，CB 0.089%，CG 0.131%)、Saccharibacteria门(Bacteroidetes，CB 0.029%，CG 0.122%)、纤维杆菌门(Fibrobacteres，CB 0.003%，CG 0.052%)、梭杆菌门(Fusobacteria，CB 0.027%，CG 0.015%)、Others(CB 0.003%，CG 0.052%)。CG组厚壁菌门与拟杆菌门的比值(3.25)高于CB组(2.54)。图3

注：图中分别是CB组和CG组的细菌门分类丰度(A)和2组中每个样的细菌门分类的丰度(B).其中Y 轴表示百分比含量；X 轴分别表示2组样及每个样本.菌门信息根据中间图例进行颜色编码Note:The figure shows the dominant phyla abundance of CB and CG groups and the dominant phyla abundance of each sample in two different groups.Y-axis represents the percentage of the content,and X-axis represents the saliva sample between two groups and each subject.The phyla information is color-coded according to the legend in the middle图3 CB 及CG 组细菌门分类水平的比较Fig.3 Comparison of bacteria groups at phylum level between CB and CG

2.3.2 细菌的科水平分布

研究表明，CB组有11个优势菌科，CG组有9个优势菌科，依次为瘤胃球菌科(Ruminococcaceae，CB 41.87%，CG 50.20%)、理研菌科(Rikenellaceae，CB 13.80%，CG 10.04%)、毛螺菌科(Lachnospiraceae，CB 10.14%，CG 8.90%)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae，CB 8.99%，CG 4.01%)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae，CB 4.65%，CG 4.75%)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae，CB 3.49%，CG 5.03%)、拟杆菌科(Bacteroidaceae，CB 3.69%，CG 3.84%)、Family_XIII科(Family_XIII，CB 0.96%，CG 2.93%)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae，CB 1.26%，CG 0.95%)、p-2534-18B5_gut科(p-2534-18B5_gut_group，CB 1.02%，CG 1.12%)、拟杆菌目S24-7科(Bacteroidales_S24-7_group，CB 1.27%，CG 0.75%)、梭菌科(Clostridiaceae_1，CB 1.79%，CG 0.19%)、Others(CB 0.003%，CG 0.052%)。图4

注：图中分别是CB组和CG组的细菌科分类丰度(A)和2组中每个样的细菌科分类的丰度(B).其中Y 轴表示百分比含量；X 轴分别表示2组样及每个样本.菌门信息根据中间图例进行颜色编码Note:The figure shows the dominant family abundance of CB and CG groups and the dominant family abundance of each sample in two different groups.Y-axis represents the percentage of the content,and X-axis represents the saliva sample between two groups and each subject.The family information is color-coded according to the legend in the middle图4 CB 及CG 组细菌科分类水平的比较Fig.4 Comparison of bacteria groups at family level between CB and CG

2.4 多样品比较

2.4.1 样品主成分和主坐标

研究表明，CB组的样品和CG组的样品依据所处组别而相互聚类到一起，表明CB组和CG组的组内相似性比组间相似性高，也说明CB组和CG组的菌群多样性存在差异。图5，图6

图5 Beta 多样性的主成分分析(PCA)Fig.5 Principal Component Analysis(PCA)scores plot of beta diversity

图6 Beta 多样性的主坐标分析(PCoA)Fig.6 Principal coordinate analysis(PCoA)scores plot of beta diversity

2.4.2 样品聚类分析

为了进一步研究不同样品间的相似性，结合样品间物种组成的相似性和细菌丰度的相似性，构建了UPGMA聚类树与柱状图结合图，左下方图注颜色代表聚类树样品所在分组的颜色，右上方图注代按属水平细菌丰度排名前10的细菌，其他归为Others，未注释到的物种归为Unclassified。其中左图为样品聚类树，通过Python语言工具对样品进行层次聚类，用以判断各样品间物种组成的相似性，样品越靠近，枝长越短，说明两个样品的细菌组成越相似；右图为各样品属水平的丰度柱状图，用以判断各样品间细菌丰度的相似性，根据各色块所占比例比较各样品的物种多样性高低、丰度相似性以及优势物种。结果与PCA的分析结果类似，CB组5个样品和CG组5个样品各自被聚为一支。图7

图7 样品聚类树柱状组合图Fig.7 Clustering tree and histogram combined graph of samples

2.5 组间物种差异

2.5.1 组间样品LEfSe

利用LEfSe[18](Line Discriminant Analysis(LDA)Effect Size)方法寻找2组间具有统计学差异的物种。以默认的LDA Score值4为标准，将大于此值的物种作为Biomarker(生物标识)，LDA柱形图长度越长代表差异物种对组间差异性的影响越大。在物种系统发育关系树中将Biomarker展示出来，其颜色由其对所在组产生重要影响最大的组的颜色决定。LDA值分布柱状图显示CB组中拟杆菌门(Bacteroidetes)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、拟杆菌目(Bacteroidales)、理研菌科(Rikenellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、Paeni梭菌属(Paeniclostridium)丰度显著高于CG组，CG组中厚壁菌门(Firmicutes)、(Ruminococcaceae)瘤胃球菌科的丰度显著高于CB组。图8

图8 LDA值Fig.8 Histogram of LDA score

2.5.2 组间样品Metastats

由于舍饲夏洛莱牛和放牧夏洛莱牛粪便的一些细菌类群的丰度差异较大。为了研究2组样品间细菌群落丰度的差异，利用Metastats[19]软件对组间的物种丰度数据进行T-test；得到P值，根据P<0.05筛选出导致2组样品组成差异的物种。2组样品中不同分类水平相对丰度较高且差异显著的菌群，在门水平，舍饲夏洛莱牛组中的拟杆菌门(Bacteroidetes)和螺旋体门(Spirochaetae)相对丰度显著高于放牧夏洛莱牛；舍饲夏洛莱牛组中的厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、Saccharibacteria门、纤维杆菌门(Fibrobacteres)相对丰度显著低于放牧夏洛莱牛；在属水平，放牧夏洛莱牛组中的Ruminococcaceae_UCG-005、Christensenellaceae_R-7_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Prevotellaceae_UCG-004、Roseburia相对丰度显著高于舍饲夏洛莱牛；舍饲夏洛莱牛组中的Rikenellaceae_RC9_gut_group、Peptoclostridium、Paeniclostridium、Alistipes、Lachnospiraceae_UCG-008、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Clostridium_sensu_stricto_1、Cellulosilyticum相对丰度显著高于放牧夏洛莱牛。表3

表3 2组样品中不同分类水平相对丰度较高且差异显著的菌群Table 3 The relative abundance of family in the two sample group

续表3 2组样品中不同分类水平相对丰度较高且差异显著的菌群Table 3 The relative abundance of family in the two sample group

3 讨论

10个样品共获得有效序列的总数为683 814，平均测序读长在410～411 kb。在97%的相似度水平下共产生有效OTU个数为1 089，涵盖了12门24纲33目57科170属的细菌。从整体来看，舍饲夏洛莱牛(6 000个左右序列共属于1 044个OTUs)，放牧夏洛莱牛(6 000个左右序列共属于1 087个OTUs)，研究结果比周珊[20]报道的锦江黄牛粪便的细菌多样性(20 000多个16S rRNA基因序列分属于669个OTUs)更丰富多样，也说明不管舍饲夏洛莱牛还是放牧夏洛莱牛粪便微生物都非常丰富。且放牧夏洛莱牛样品中Chao1和Shannon指数(1 049.57，5.44)均高于舍饲夏洛莱牛(997.23，5.39)，放牧夏洛莱牛肠道中细菌多样性和丰度均高于舍饲夏洛莱牛，这可能和夏洛莱牛日粮结构、生活环境以及环境中的共生微生物之间的群体效应等因素有关[16]。

通过与RDP数据库[21]进行比对，放牧夏洛莱牛与舍饲夏洛莱牛的肠道细菌按丰度排在前2名的都是厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，且厚壁菌门在所有样本中丰度占比均在60%以上，占绝对优势。厚壁菌门和拟杆菌门丰度占比之和均在90%以上。在属水平上，有3%～4%未分类细菌，这说明夏洛莱牛粪便样品中还蕴含着部分人类未知的微生物种类。以往的研究表明，厚壁菌门和拟杆菌门在很多草食动物(锦江黄牛、荷斯坦牛、喜马拉雅塔尔羊、岩羊、欧洲盘羊)瘤胃和肠道微生物中均为优势菌门[9,11,12,20]，这与研究结果一致。也说明采用直肠粪便探讨夏洛莱牛肠道菌群结构和功能是可行的。

在反刍动物中，后肠道约占总消化道的17%，其为整个机体提供了5%～30%的能量[22]，说明后肠道菌群在一定程度上可以反映宿主的能量利用效率。以往研究表明，反刍动物的能量代谢效率主要受饲粮精粗比、饲草种类、饲料添加剂等因素的影响[23-24]，其肠道中厚壁菌门的相对丰度与饲粮中干草含量呈显著正相关[25,26]，且拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)在很多草食动物胃肠道微生物中均为优势菌门[27-29]。研究结果显示，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为夏洛莱牛肠道优势菌门，并且放牧夏洛莱牛肠道中厚壁菌门(73.8%)显著高于舍饲夏洛莱牛(69.3%)。研究中，放牧夏洛莱牛日粮主要由牧草组成。

牛瘤胃与肠道中的微生态系统可以帮助宿主消化动物体自身难以利用的粗纤维(纤维素、半纤维素、木质素)，从大量的低营养的植物纤维中摄取所需的能量[22]；前人研究表明，Ruminococcaceae科中的微生物能消化复杂的植物材料并产生丁酸盐，丁酸是一种对结肠细胞健康至关重要的短链脂肪酸[30]；瘤胃球菌属(Ruminococcaceaesp.)所含的白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌能分泌大量的纤维素酶和半纤维素酶，是反刍动物主要的纤维降解菌[31]。此外，梭状芽孢菌科(Clostridiaceae)中的一些菌株是动物和人类主要的病原体[32]，Paeniclostridium属和Peptoclostridium属的一些菌株能引起人和动物的感染[33,34]；研究表明，放牧夏洛莱牛肠道Firmicutes类所占比例(73.8%)比舍饲夏洛莱牛肠道Firmicutes类所占比例(69.3%)高，舍饲夏洛莱牛肠道Bacteroidetes类所占比例(27.3%)比放牧夏洛莱牛肠道Bacteroidetes类所占比例(22.7%)高，放牧夏洛莱牛的厚壁菌门与拟杆菌门的比值(CG 3.25，CB 2.54)、梭菌科(Coriobacteriaceae)的丰度(CG 0.76%，CB 0.28%)和瘤胃球菌科丰度(CG 52.2%，CB 41.9%)显著高于舍饲夏洛莱牛(<0.01)，放牧夏洛莱牛的Paeniclostridium属和Peptoclostridium属显著低于舍饲夏洛莱牛(<0.05)，放牧夏洛莱牛具有比舍饲夏洛莱牛具有更强的消化纤维素、半纤维素的能力，且肠道微生物菌群相对更健康，因此，更适应放牧以及低能量的粗纤维的进食环境。