用CRISPR-Cas9在绵羊成纤维细胞ACTG1导入荧光标记基因

郭延华，皮文辉

(绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆石河子 832000)

0 引 言

1 材料与方法

1.1 材 料

pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(Addgene，42230)，pCAS9-mCherry-Frame+1(Addgene,66940)，pCRISPaint-TagGFP2-PuroR(Addgene，80970)，pMAX(VDC-1040,Lonza)电转仪(Amax NucleofectorⅡ)，流式细胞仪(BDFACSAria Ⅲ)。绵羊原代成纤维细胞采自新疆农垦科学院畜牧兽医研究所种羊场，采集8月龄试验羊只耳缘组织，带回实验室原代培养保存。

QuickExtract DNA 抽提液(QE09050，Epicentre)、PrimerSTAR DNA Polymerase(R045，Takara)、Surveyor 凝胶电泳突变检测试剂盒(706025，Transgenomic)、10× T4ligase buffer(B0202S,NEB)、T4PNK(M0201S,NEB)、2X rapid ligase buffer(B1010,Enzymatics)、T7ligase(L6020L,Enzymatics)和FastDigestBbsI(FD1014,Fermentas)。

细胞培养皿、离心管(Nunc)；DMEM 高糖培养液(61965059，Gibco)；胎牛血清(LOT1407738，BI)；胰酶替代物 TrypLETMExpress(1X)(12604-021，Gibco)。

1.2 方 法

1.2.1 gRNAs(guide RNAs)设计

针对绵羊ACTG1基因TAA终止密码子位点，3’端保留PAM(NGG)。表1

表1 绵羊ACTG1基因羧基端gRNAs序列Table 1 Oligo sequences of C-terminal targets of sheep ACTG1 gene

AGCAGGAGTATGATGAGTCCACCGCAAATGCTTCTAAAGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATGATGAGTCTGGCCCCTCCATTGTCCACCGCAAATGCTTCTAAACGGACTGCGAGCAGACAAATGCTTCTAAACGGACC

1.2.2 gRNA质粒克隆

王积薪手捻一粒黑玉棋子停了下来，一张白玉般的脸变成了酱紫色，半晌抬头对星雨道：“那夜月光入户，照在床枕边，徘徊转移，有一刻就停留在她的脸上。”

磷酸化退火gRNA寡核苷酸，BbsI酶切pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒，用Golden Gate克隆体系，将退火寡核苷酸连接，构建gRNA质粒。首先将合成的正向和反向gRNA寡核苷酸用水稀释至100 μm，分别取1与6.5 μL的水混合，加入10×T4ligase buffer 1 μL和T4PNK 0.5 μL，将10 μL液体混匀，水浴37℃ 30 min。然后将反应管转入PCR仪，95℃ 3 min，直接关闭PCR仪，保持关闭PCR仪顶盖，室温下自动降温退火30 min。将双链退火的反应液补加90 μL水稀释10倍，混匀代用。Golden Gate反应体系是：2×rapid ligase buffer 5 μL、BSA(20 mg/mL)0.3 μL、FastDigest BbsI 0.5 μL、T7 ligase 0.5 μL、退火稀释的gRNA溶液1 μL、pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(25 ng/μL)1 μL和水2.0 μL，混匀。37℃ 水浴60 min。取2～5 μL 连接反应液，直接转染50 μL感受态Stbl3。抗性Amp的LB固体培养基涂板，37℃ 16 h培养。

1.2.3 细胞转染

采用电转染绵羊成纤维细胞。待细胞生长至培养皿的80%，消化收集2×105个细胞，20 μL电转液[7]悬浮，加入相应的质粒，将电击杯放置于电转仪的电击槽中，运行CZ-167电转程序，培养液悬浮细胞后铺于6孔板中培养。

1.2.4 CRISPR-Cas9系统活性检测

检测3个gRNA质粒编辑效率，电转染20 μL，添加gRNA质粒1 μg。培养72 h收集细胞，用30 μL QuickExtract DNA 抽提液裂解细胞，水浴65℃ 10 min；95℃ 15 min。获得的细胞裂解液作为基因组DNA模板，ShACTG1-F：AGCATGACTGACCTCCCTTTG 和shACTG1-R：CCCAACCCCATGTAAGACCG引物，primeSTAR酶扩增，98℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 5s(38个循环)；72℃ 2 min；25℃ ∞。电泳切胶回收后，按照Surveyor 凝胶电泳突变检测试剂盒说明进行检测。

1.2.5 流式细胞检测

ACTG1基因标记组的细胞，电转染20 μL体系添加的质粒是：250 ng基因组编辑的gRNA质粒、250 ng供体模板gRNA质粒pCAS9-mCherry-Frame+1、500 ng供体模板质粒pCRISPaint-TagGFP2-PuroR。同时单独电转500 ng供体模板质粒pCRISPaint-TagGFP2-PuroR样品，观察细胞荧光。电转阳性细胞样品250 ng红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)质粒pCAS9-mCherry-Frame+1和250 ng绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)质粒pMAX，作为流式细胞仪红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白细胞标准。电转染细胞培养72 h，用荧光显微镜观察成纤维细胞GFP和RFP表达。然后收集细胞。重悬在0.5 mL的PBS中，流式细胞仪分析(BDFACSAriaⅢ，FACSDiva Version 6.1.3)。FITC通道检测GFP细胞，PE通道检测RFP细胞。每份样品细胞计数超过10 000个。

1.2.6 单克隆筛选

电转染20 μL体系添加的质粒是250 ng pX330-Cas9-ACTG1-2质粒、250 ng pCAS9-mCherry-Frame+1质粒、500 ng模板质粒pCRISPaint-TagGFP2-PuroR，培养60 h，加入嘌呤霉素1 μg/mL培养液，持续培养5 d，直至培养皿底部形成细胞克隆。用PBS漂洗2遍。然后加入8倍稀释的PBS胰酶替代物消化液，室温静置7 min。在体式显微镜下用口吸管吸取单克隆细胞。转入96孔板中继续培养，经过1次传代培养，直至长满3孔，收集用于检测。

1.2.7 测 序

将收集的嘌呤霉素抗性筛选的单克隆细胞，用30 μL QuickExtract DNA 抽提液裂解细胞，水浴65℃ 10 min；95℃ 15 min。获得的细胞裂解液作为基因组DNA模板，ShACTG1-F和shACTG1-R引物，primeSTAR酶扩增，98℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 6 min(38个循环)；72℃ 10 min；25℃ ∞。电泳切胶回收后，PCR产物直接送样测序，测序引物是ShACTG1-F 和shACTG1-R。

2 结果与分析

2.1 绵羊成纤维细胞ACTG1基因终止密码子附近CRISPR-Cas9的gRNA靶向活性

绵羊成纤维细胞ACTG1基因终止密码子附近设计的3个gRNA位点，电转染导入CRISPR-Cas9表达系统质粒，培养72 h后。图1

图1 Surveyor检测CRISPR-Cas9系统的电泳图Fig.1 CRISPR-Cas9 surveyor detection gel electrophoresis map

1、2和3号泳道样本同正常细胞C泳道样品比较，存在不同的DNA异源双链杂交酶切带型，说明3个设计的gRNA靶点，采用CRISPR-Cas9系统，在绵羊成纤维细胞的基因组ACTG1基因终止密码子靶点附近，成功诱导产生DNA双链断裂，经细胞修复后产生突变。

2.2 流式细胞仪检测

荧光显微镜观察标记实验组，看到有RFP细胞和红绿两色的荧光细胞，初步判定GFP基因标记成功。荧光显微镜观察供体模板质粒pCRISPaint-TagGFP2-PuroR的细胞样品，未见到GFP。流式细胞仪检测坐标图显示，Q1区域是RFP细胞，Q2区域是RFP+GFP双色荧光细胞，Q4区是GFP细胞。pX330-Cas9-ACTG1-1、pX330-Cas9-ACTG1-2和pX330-Cas9-ACTG1-3质粒电转标记组，红绿双色荧光细胞比率占整个检测细胞分别是0.4%、1.4%、0.8%。图2

注：Q1(左上象限)为Y轴阳性细胞；Q2(右上象限)为双阳性细胞；Q3(左下象限)为双阴性细胞；Q4(右下象限)为X轴阳性细胞Note:图2 流式细胞仪检测绵羊ACTG1羧基端标记效率Fig.2 FACS analysis and efficiency of C-terminal tag GFP in sheep ACTG1 gene

由于pCAS9-mCherry-Frame+1质粒表达RFP，流式细胞仪检测计数的RFP细胞数量(Q2+Q1)，就是pCAS9-mCherry-Frame+1质粒在绵羊成纤维细胞中的转染效率。实验采用的转染体系，流式细胞仪检测结果显示，pCAS9-mCherry-Frame+1质粒在绵羊成纤维细胞转染效率达4%～7.5%。而pMAX细胞样品组，流式细胞仪检测的转染效率达40%。转染效率差异显著的主要原因是2个质粒大小差异显著，pMAX(3 486 bp)和pCAS9-mCherry-Frame+1(10 122 bp)。

2.3 PCR扩增检测

终止密码子5’连接端，ShACTG1-F测序结果比较分析显示，整合的外源基因片段，消除了终止密码子。缺失和插入碱基数都是3连密码子整数倍，整体序列没有发生移码，编码框可以正常编码GFP密码子。筛选得到克隆细胞株都实现了GFP基因编码框的正确阅读，可以正常转录翻译表达蛋白，这也符合抗性标记嘌呤霉素选择的结果。图3

图3 ACTG1羧基端标记5’测序结果比对Fig.3 Comparison of 5 'sequencing results of ACTG1 C-terminal tag GFP

终止密码子3’连接端，ShACTG1-R测序结果比较分析显示，抗性标记选择的细胞克隆，整合了不同长度的供体模板骨架。红色字母是绵羊细胞基因组序列，下划线黑斜体字母是pCRISPaint-TagGFP2-PuroR骨架序列。后面数字是3’端碱基对应的供体模板质粒骨架上的位置。图4

图4 ACTG1羧基端标3’测序结果比对Fig.4 Comparison of 3 'sequencing results of ACTG1 C-terminal tag

3 讨 论

人工核酸内切酶(Engineered endonuclease,EEN)定点切割基因组，产生特定位点基因组双链断裂(Double-strand brakes,DSBs)或切口(Nicks)，为剖析生物体的基因功能研究和应用，开辟了新的方式[1,2,8,9,10]。

提高外源基因精确导入基因组的效率，是基因组编辑重要应用之一[11]。基因导入起源于基因打靶技术[12]。基因打靶技术利用了HR修复途径，将外源DNA片段精确导入靶位点。基因打靶技术效率极其低，主要是因为HR修复途径在细胞内采用频率低。当EEN在细胞内诱导产生DSB后，存在3条可能的修复途径：HR、NHEJ和MMEJ[13]。NHEJ修复途径在细胞内采用频率非常高，为了获得高的基因导入效率，NHEJ修复途径是一个较好的选择。通过NHEJ修复途径，获得了较高的基因导入效率[14-19]。在细胞内，利用EEN同时在活细胞的基因组和供体模板中诱导DSB，通过NHEJ修复途径，使得线性化供体模板和切割的基因组之间发生连接。在斑马鱼和植物中，敲入效率达30%[17,19]。

CRISPaint技术是模块化基因标记系统，利用CRISPR-Cas9系统，在细胞内共同实现基因组和供体模板不同靶点断裂，通过NHEJ修复途径，将供体模板导入基因组特定位点[3,5]。利用CRISPaint技术，在绵羊成纤维细胞ACTG1基因羧基端标记GFP效率达1.4%。通过嘌呤霉素选择，获得了基因标记成功的单克隆细胞。

测序嘌呤霉素选择获得的单克隆细胞，显示NHEJ连接修复呈现不同序列，缺失和插入碱基数都是3连密码子整数倍，整体序列没有发生移码，编码框可以正常编码GFP和嘌呤霉素抗性蛋白。NHEJ修复连接产生很多结果，而那些发生移码的修复细胞，在嘌呤霉素选择下将无法生存。单克隆细胞3’端连接，呈现不同的骨架片段，说明线性化供体模板在细胞内受多种因素作用，发生不同位点断裂。

利用CRISPR-Cas9系统，结合MMEJ修复途径，也实现了高效的基因组定点整合外源基因[20,21,22]。该方法由于需要微同源臂，实施起来需要针对不同位点构建包含微同源臂质粒。CRISPaint方法利用NHEJ修复途径，包含大量模块化质粒。如果是标记或干扰目的基因，无需构建质粒。CRISPR-Cas9系统，结合NHEJ精确导入外源基因，是一种高效便利的技术[3,4]。

4 结 论

CRISPaint通过cNHEJ在CRISPR-Cas9作用的细胞中整合异源遗传物质，提供了一种简单、精确和快速的方法[3]。利用CRISPaint能够快速有效的将大的外源DNA序列插入绵羊成纤维细胞的预定基因组位点。针对绵羊ACTG1基因终止密码子位点，导入荧光标记基因，流式细胞仪检测，整合效率达1.4%。同时，pCAS9-mCherry-Frame+1质粒在绵羊成纤维细胞转染效率是4%～7.5%，说明10 kb左右大小的Cas9相关质粒，转染效率较低。因此，提高CRISPaint系统的Cas9相关质粒转染效率，将改善外源基因定点整合进入绵羊成纤维细胞基因组的效率。