?规模化养猪场沼液中原核微生物的分离与鉴定?

?邹坤 杨佳珏 赵彩宏 谢伦宏 贺爱兰

摘 要：为充分利用规模化养猪场的沼液资源，防止农业面源污染，采集了娄底市周边的4个猪场发酵罐出口和曝气池出口处的沼液进行原核微生物的分离与鉴定，并对从中分离纯化出的大肠杆菌K-12、大肠杆菌IAI和枯草芽孢杆菌 PS832进行了理化性质和相关抗性研究。结果表明：大肠杆菌K-12对氨苄青霉素和卡那霉素具有一定的抗性;大肠杆菌IAI对氨苄青霉素和链霉素不敏感，但对庆大霉素和卡那霉素敏感;枯草芽孢杆菌 PS832对氨苄霉素、卡那霉素和庆大霉素敏感，对链霉素不敏感。此外，研究显示用200 W超声波间断性处理这3类菌株20～30次（工作10 s、间歇10 s为1次）可以达到理想灭菌效果。

关键词：规模化养猪场;沼液;原核微生物;理化分析

中图分类号：S828; X713文献标识码：A文章编号：1006-060X（2020）10-0067-05

Abstract： Biogas slurry is rich in nitrogen， phosphorus， potassium and other physiological active substances， but harmless treatment is difficult. How to use it as resources is an important content of agricultural non-point source pollution control. In this paper， the biogas slurry at the outlets of fermentation tanks and aeration tanks of four pig farms around Loudi City was sampled. Escherichia coli K-12， Escherichia coli IAI and Bacillus subtilis PS832 were obtained from biogas slurry through isolation and purification， and their physicochemical properties and related resistances were determined. The results show that Escherichia coli K-12 is resistant to ampicillin and kanamycin; Escherichia coli IAI is not sensitive to ampicillin and streptomycin， but sensitive to gentamicin and kanamycin; Bacillus subtilis PS832 is sensitive to ampicillin， kanamycin and gentamicin， but not sensitive to streptomycin. The ideal sterilization for the 3 types of bacteria could be achieved by periodic treatment with 200 W ultrasonic waves for 20-30 times （each time run for 10s with a 10s interval）.

Key words： large-scale pig farms; biogas slurry; prokaryotic microorganism; physicochemical analysis

沼气发酵技术在我国应用历史长久，在各級政府政策和财政的支持下，各类沼气工程连续几年迅猛发展，带来了大量的生物能源，减少了农用废弃物，增加了经济效益，但与此同时，沼气工程在产生沼气的同时，大量的沼液随之产生，如何合理利用使之变废为宝，成为急待解决的另一个课题[1]。已有研究发现，沼液中含有丰富的营养物质及微量元素，沼液的主要利用方式则包括直接归田或与其他肥料配合归田[2]、沼液浸种[3]、叶面肥[4]、饲料添加剂等。与沼渣相比，沼液的养分含量较低，且不易运输，储藏，具有二次产气等特点，无害化处理难度较大， 因此，有必要了解不同地区以及以不同底物发酵的沼液的理化性质及特性，为其合理利用提供理论依据。此外，沼液中含有种类丰富，数量巨大的微生物，并被证实具有增产和改善农作物品质的作用，具有生物肥料和生物农药的双重功效[5-7]。近年来相关学者进行了沼液中微生物的分离，从沼液中分离出一株酵母菌，并对其分类地位进行了研究[8]。很多学者研究了沼液对草莓土传病害的防治效果，并从中分离了拮抗细菌[9]。还有学者对不同季节的沼液中细菌的形态与含量进行了研究[10]。笔者对从沼液中分离纯化出的大肠杆菌K-12、大肠杆菌IAA和枯草芽孢杆菌 PS832进行理化性质和相关抗性研究，旨在为沼液的运用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试样本 沼液样本采集于娄底市新化、双峰等地区的4个生猪规模养殖场，采集点为发酵罐出口和曝气池出口处。

1.1.2 试剂和仪器设备 实验室主要试剂为氯化钠（NaCl）、氨苄霉素（AMP）、卡那霉素（Kana）、庆大霉素（Genta）、链霉素（Strept）、草酸铵（A.oxa）等，其他试剂：酵母浸出液体、无水乙醇、胰蛋白胨、琼脂粉、蒸馏水、甘油、无菌水、结晶紫、碘液、95%乙醇、蕃红染液。仪器设备：EP管、烧杯、锥形瓶、培养箱、冰箱等。

1.2 试验方法

1.2.1 样本前处理 采集的沼液样本存放于2 mL EP管中，每个点取样为3管，共6 mL，做好标记。

1.2.2 培养液和培养基的配置 培养液和培养基为LB，配方：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，蒸馏水1 L，琼脂15～20 g /L （用于培养基）。配制流程如下：称取胰蛋白胨4 g、酵母提取物2 g、氯化钠4 g，放入500 mL烧杯中;加入400 mL蒸馏水用玻璃棒搅拌均匀直至溶解;分别倒入2个250 mL的锥形瓶中，每个锥形瓶200 mL溶液;分别称取琼脂粉2份，每份4 g，然后分别加入2个锥形瓶中，用棉塞将锥形瓶口塞严后用报纸包裹瓶口，并用细绳帮助固定报纸。

1.2.3 涂板培养 将猪场采集的沼液样本进行涂板培养，分别取200 μL样本涂布到配制好的LB培养板上，具体操作如下：（1）将涂布器放在火焰上灼烧灭菌，在火焰旁冷却涂布器;（2）打开盛有原沼液的EP管，将试管口通过火焰;用200 μL移液器吸取200 μL标号为1-1的原沼液缓慢打入LB培养板中，将已冷却的涂布器将原液涂布均匀，将试管口过火焰，并塞上棉塞，灼烧涂布器，待其冷却;（3）重复以上操作，分别涂布好样本;（4）将平板倒置，放入37℃培养箱中培育24～48 h后查看其菌落生长状况并拍照记录。

1.2.4 单菌落培养 用接种环挑取远离群菌落的单菌落划线培养。

1.2.5 革兰氏染色 将分离纯化出的无污染的单菌落挑出，进行革兰氏染色。革兰氏染色法[10]。

1.2.6 菌种保存 （1）将要保存菌种接种于LB液体培养至对数生长期（肉眼可见培养液浑浊即可）。（2）将300 μL甘油装于1 mL离心管中并和枪头等试验用品用高压灭菌锅于121℃灭菌30 min。（3）无菌条件下将菌液700 μL混合于装有甘油的离心管中，于-80℃冰箱内保存。

1.2.7 菌种鉴定 将甘油保存好的菌种的其中一份快递寄到上海生工进行16sRNA测序。登陆NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），将测序结果进行BLAST比对，选择100%匹配的结果为菌种的种名。

1.2.8 抗性试验 确定菌种后使用常见的抗生素（氨苄、卡纳、庆大霉素、链霉素）对其进行处理，试验前准备好1 000、200 、100 μL枪头，用枪头盒装好以及用报纸包裹好后灭菌。培养基配置倒板前加入抗生素液体（氨苄、卡纳、庆大霉素、链霉素），摇匀后倒板。做好抗生素板后，接种单菌落进行恒温箱37℃过夜培养，观察是否有菌落长出。

1.2.9 超声波实验 挑取单菌落进行小管扩大培养，5 h后观察培养液是否变浑浊，然后进行OD600的浓度测量，稀释10倍后，将装有菌液的5 mL EP管放入细胞超声波破碎机（置于冰上破碎）。同时，取原菌液200 μL进行涂板，标记为1号板。设置功率为200 W，间断性地超声（工作10 s，间歇10 s）。第一次超声波次数为10次，然后吸取200 μL进行涂板，标记为2号板。轻轻摇匀后继续超声10次，吸取200 μL进行涂板，标记为3号板，依次进行上述超声和涂板，超声波次数分别为0、10、20、30次。涂板培养后观察结果。

2 结果与分析

2.1 沼液涂板

4个猪场分别编号为1、2、3、4号猪场，在每个点取样中各取200 μL沼液样本涂板，菌落长势情况如图1、图2。

2.2 菌落形态观察

2.2.1 未知菌落1 挑取单菌落在37℃下培养18 h后形成的单菌落直径约1.5 mm左右。菌落呈现灰白、半透明，小凸起，边缘整齐光滑，在LB培养板上培养有特殊气味产生。菌落形态见图3A。

2.2.2 未知菌落2 挑取单菌落在37℃下培养18 h后形成的菌落，菌落形态为白色，圆形，表面光滑，半透明，边缘潮湿。培养结果见图3B。

2.2.3 未知菌落3 挑取单菌落在37℃下培养18 h形成菌落，菌落较大，表面呈白色，表面典型的粗糙不规则，有较多隆起和褶皱，膨大化，邊缘不透明。培养结果见图3C。

2.3 革兰氏染色

对未知菌落1的革兰氏染色后，呈现出红色，鉴定为革兰氏阴性菌（见图4A）;对未知菌落2的革兰氏染色后，呈现出红色，鉴定为革兰氏阴性菌（见图4B）;对未知菌落3的革兰氏染色后，呈现出紫色，鉴定为革兰氏阳性菌（见图4C）。

2.4 测序鉴定

将菌液样本送到上海生工测序，将序列通过BLAST比对，在基因库中找出匹配率最高的物种，结果未知菌落1、2、3分别为大肠杆菌K-12、大肠杆菌IAI、枯草芽孢杆菌PS832。

2.5 抗性分析

2.5.1 大肠杆菌K-12 将大肠杆菌K-12分别接种于氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素的抗生素板上，结果表明K-12对氨苄青霉素、卡那霉素有一定的抗性，对链霉素和庆大霉素较为敏感（见图5）。

2.5.2 大肠杆菌IAI 将大肠杆菌IAI分别接种于氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素的抗生素板上，结果表明IAI对氨苄青霉素和链霉素不敏感，但对庆大霉素和卡那霉素敏感（见图6）。

2.5.3 枯草芽孢杆菌PS832 将枯草芽孢杆菌PS832分别接种于氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素的抗生素板上，结果表明草芽孢杆菌 PS832对氨苄霉素，卡那霉素和庆大霉素敏感，对链霉素不敏感（见图7）。

2.6 超声波处理

超声波处理结果（图8-10）表明，以功率200 W超声波破碎机超声破碎10次能杀灭部分细菌，20次、30次超声波处理可以达到理想灭菌效果。

3 结 论

3.1 大肠杆菌IAI

经过鉴定与分析，发现大肠杆菌IAI对庆大霉素和卡那霉素极为敏感，超声波也能影响大肠杆菌IAI的生长，此次研究发现，在沼液中加入庆大霉素、链霉素两种抗生素能够抑制部分菌的生长，但是长期使用抗生素容易使菌变异产生抗药性，而且经济成本太高，若将发酵后的沼液经过功率为200 W，且大于30次超声波处理，就能够将其中的部分细菌杀死，就能将沼液循环利用。

3.2 大肠杆菌K-12

经过鉴定与分析，发现大肠杆菌K-12对氨苄青霉素和卡那霉素两种抗生素具有一定的抗性，但庆大霉素、链霉素两种抗生素能够抑制大肠杆菌k-12生长，但是长期使用抗生素容易使菌变异产生抗药性，若利用功率为200 W，且大于30次超声波处理，就能够将大部分细菌杀死，就能将沼液循环利用。

3.3 枯草芽孢杆菌PS832

经过鉴定与分析，发现枯草芽孢杆菌PS832对氨苄青霉素、庆大霉素和卡那霉素都极其敏感，所以对其的处理也是较为容易的。链霉素对大部分的革兰氏阳性菌都存在抑制作用[9]，可是在本实验中对枯草芽孢杆菌生长无影响。枯草芽孢杆菌PS832对链霉素不敏感的原因可能是实验猪场长期使用链霉素作为生猪的治疗药剂，导致其产生抗药性，当然也可能是出现了噬菌体污染的情况，不过还需要进一步验证[11]，当然超声处理也能起到杀灭枯草芽孢杆菌PS832的作用。

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（责任编辑：张焕裕）