油茶炭疽病病原菌鉴定及防治药剂筛选

尹华庆，王建田，刘 敏

（1. 隆回县横板桥镇农业综合服务中心，湖南 邵阳 422200；2. 隆回县七江镇农业综合服务中心，湖南 邵阳 422205；3. 湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128）

油茶是我国特有的木本油料作物，与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本食用油树种。而油茶产业也是湖南省非常重要的农业支柱产业[1]。我国油茶常见病害约有20 种，其中以炭疽病、煤污病和软腐病的发生较普遍且严重[2-3]。油茶炭疽病主要引起油茶叶片枯死及花果早落，严重时可使油茶减产率超过50%，其病原菌主要为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）[4]。笔者从田间发病的油茶叶片上进行病原菌的分离与鉴定，并开展杀菌剂对油茶炭疽病致病菌的室内毒力测定，以期为油茶炭疽病的田间防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料：油茶炭疽病病叶于2019 年采集自湖南省邵阳市隆回县横板桥镇油茶种植基地，用样品袋装好带回实验室备用。油茶炭疽病菌的培养及室内药剂筛选在PDA 培养基上进行。

供试药剂：80%戊唑醇可湿性粉剂（淄博新农基作物科学有限公司）；40%腈菌唑可湿性粉剂（山西运城绿康实业有限公司）；6%春雷霉素可湿性粉剂（陕西省临猗中晋化工有限公司）；10%苯醚甲环唑微乳剂（中国农业科学院植物保护研究所廊坊农药中试厂）；50%甲基硫菌灵可湿性粉剂（四川国光农化股份有限公司）；30%肟菌·戊唑醇悬浮剂（拜耳作物科学有限公司）；43%氟菌·肟菌酯悬浮剂（拜耳作物科学有限公司）；400 g/L 氟硅唑乳油（江门市大光明农化新会有限公司）；75%百菌清可湿性粉剂（四川国光农化股份有限公司）；50%多菌灵可湿性粉剂（四川国光农化股份有限公司）。

基因组DNA 提取试剂盒、PCR 扩增试剂盒、真菌ITS 通用引物ITS1/ITS4，均购自北京全式金生物技术（TransGen Biotech）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 油茶炭疽病病原菌分离及致病性测定 采用组织分离法从感染油茶炭疽病的油茶叶片病健交界处分离病原真菌，分离得到的真菌回接至健康油茶叶片，能够产生相同病斑的即为油茶炭疽病病原真菌。从接种后发病的油茶叶片再次分离病原菌，并与原来分离的病原菌比较，以验证该病菌是否符合柯赫氏法则。将纯化好的病原菌株命名为YCTJ，保存于4℃冰箱备用。

1.2.2 病原菌鉴定 （1）形态学鉴定。将病原菌YCTJ 在PDA 平板上进行活化培养，用打孔器（直径6 mm）从活化好的菌落边缘打孔移取菌饼，转移至新的PDA 平板，设置5 个重复，将平板置于恒温培养箱中培养，观察菌落形态，并在显微镜下观察病原菌分生孢子的形态。（2）分子生物学鉴定。采用试剂盒提取病原菌YCTJ 的基因组DNA，电泳检测提取DNA 质量后，采用真菌ITS 序列通用扩增引物ITS1/ITS4（5′-CCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对病原菌基因组DNA 的ITS 序列进行扩增，扩增产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将ITS 测序结果在NCBI 中进行BLAST 比对，根据比对结果选取代表性序列，采用MEGA 6.0 软件构建进化树，结合形态学特征和系统进化树对油茶炭疽病病原进行鉴定。

1.2.3 室内药剂筛选试验 用约70℃的无菌PDA 培养基将各药剂分别按推荐剂量稀释，制成含杀菌剂的混药平板备用。采用生长速率法测定不同药剂对油茶炭疽病病原菌生长的影响。在含杀菌剂的PDA 培养基中接入活化好的供试菌株菌饼（d=6 mm），置于25℃培养箱中黑暗培养，7 d 后待空白对照菌落长满平板时用“十字交叉法”测量菌落直径，每种药剂设3 个重复，以无菌水作为对照。

2 结果与分析

2.1 油茶炭疽病病原菌的分离鉴定

2.1.1 致病菌分离 采用组织分离法得到YCTJ，将分离得到的真菌采用刺伤接种法回接至健康油茶叶片上，产生的病斑和田间病斑基本一致（图1），从接种后发病的油茶叶片分离的病原菌与原来接种的病原菌保持一致。这表明分离的真菌符合柯赫氏法则，即所得真菌是油茶炭疽病的病原菌。

2.1.2 形态学鉴定 油茶炭疽病病原菌YCTJ 在PDA平板上的菌落形态如图2 所示。从图2 可以看出，YCTJ 菌株菌落在PDA 平板上为圆形，边缘整齐，菌丝为白色，较为茂密，后期转为灰色或浅褐色，菌落背面为灰褐色；分生孢子呈长椭圆形，单孢，无色，两端钝圆或一头稍尖，两端可见油球。通过形态学特征分析将YCHJ 初步鉴定为胶孢炭疽菌。

2.1.3 分子生物学鉴定 采用试剂盒提取油茶炭疽病菌全基因组DNA，利用真菌ITS 扩增通用引物进行扩增，扩增产物经测序得到全长为1 416 bp 的片段，将油茶炭疽病病原菌YCTJ 菌株的ITS 序列登录到NCBI 中进行比对，发现YCTJ 菌株与登录号为AJ301908.1 的菌株同源性为98%。构建了基于ITS 序列的油茶炭疽病菌进化树，如图3 所示，YCTJ 与胶孢炭疽菌处于同一分支。结合YCTJ 菌株的菌落形态，将YCTJ 菌株最终鉴定为胶孢炭疽菌。

2.2 不同杀菌剂对油茶炭疽病菌的抑制效果

由表1 可知，400 g/L 氟硅唑乳油、10%苯醚甲环唑微乳剂、80%戊唑醇可湿性粉剂、30%肟菌·戊唑醇悬浮剂和43%氟菌·肟菌酯悬浮剂这5 种杀菌剂对油茶炭疽病菌的抑制明显，菌丝生长抑制率在98.41%～100%之间，可以作为油茶炭疽病田间防治的备选药剂。

图1 采集的油茶病叶（左）及病原菌接种后病斑形态（右）

图2 油茶炭疽病病原菌YCTJ 的菌落及分生孢子形态

图3 基于ITS 序列的油茶炭疽病菌进化树

表1 10 种杀菌剂对油茶炭疽病菌的抑制效果

3 结论与讨论

采用组织分离法分离得到了油茶炭疽病病原菌YCTJ，通过柯赫氏法则验证、形态学和分子生物学鉴定以及系统发育树的构建，证实其病原菌为胶孢炭疽菌。目前关于油茶炭疽病菌病原菌鉴定的报道较多，笔者的研究结果与朱英芝等[5]、叶航等[6]的报道一致。而除了胶孢炭疽菌，能引起油茶炭疽病的病原还有博宁炭疽菌（Colletotrichum boninense）[7]、卡哈瓦炭疽菌（Colletotrichum kahawae）等[8]。在油茶炭疽病的鉴定中，一般采用形态学特征结合分子生物学鉴定的手段进行，在该研究中，仅对油茶炭疽病菌的核糖体内转录间隔区（ITS）进行了扩增和测序。而通常为了保证鉴定的准确性，一般要采用多基因系统学分析方法鉴定。如李河等[9]同时对油茶炭疽病菌核糖体内转录间隔区（ITS）钙调蛋白（CAL）3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）进行了分子生物学分析。这样的鉴定准确性更高。

笔者还测定了10 种杀菌剂对油茶炭疽病菌的室内抑制效果。结果显示，400 g/L 氟硅唑乳油、10%苯醚甲环唑微乳剂、80%戊唑醇可湿性粉剂、30%肟菌·戊唑醇悬浮剂、43%氟菌· 肟菌酯悬浮剂这5 种杀 菌剂对油茶炭疽病菌的生长抑制效果均达到98%以上， 室内防效显著，可以作为田间防治的备选药剂。油茶炭疽病室内药剂筛选的报道较少，仅有陈绍红等[10]、曹志华等[11]开展了少量研究，而这几种药剂的室内毒力测定结果只是为田间防治提供了参考，这些药剂对油茶炭疽病的田间防效有待进一步验证。